Medición de la hemólisis en suero bovino por UV directo

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13523 (2022) Citar este artículo

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Se requiere un procedimiento simple y rápido para la detección y cuantificación de rutina de la hemólisis, una de las principales fuentes de resultados poco confiables en el análisis de suero. En este estudio, comparamos dos enfoques diferentes para la determinación rápida de hemólisis en suero bovino. El primero consistió en estimar la hemólisis a través de una simple medición espectrofotométrica directa ultravioleta-visible (UV-VIS) de muestras de suero. El segundo involucró el análisis de datos de color rojo, verde, azul (RGB) extraídos de imágenes digitales de muestras de suero y relacionando el contenido de hemoglobina (Hb) por medio de calibraciones tanto univariadas (R, G, B e intensidad por separado) como multivariadas (R , G, B e intensidad conjuntamente) usando regresión de mínimos cuadrados parciales y redes neuronales artificiales. El análisis UV-VIS directo y el análisis multivariado RGB utilizando métodos de redes neuronales fueron apropiados para evaluar la hemólisis en muestras de suero de ganado. Los procedimientos mostraron buena exactitud (recuperaciones medias de 100,7 y 102,1 %, respectivamente), precisión adecuada (con coeficientes de variación de 0,21 a 2,68 %), límite de detección (0,14 y 0,21 g L–1, respectivamente) y linealidad de hasta a 10 g L–1.

La hemólisis es la ruptura de las membranas de los eritrocitos con la posterior liberación del contenido celular al líquido circundante. Puede ocurrir debido a un manejo inadecuado de la muestra oa una patología. La hemólisis suele ocurrir in vitro debido a una extracción, transporte, preparación o almacenamiento incorrectos de la muestra. La hemólisis in vivo es menos frecuente y se produce antes de la extracción de sangre debido a condiciones patológicas como infecciones, efectos tóxicos, enfermedades inmunomediadas, trastornos hereditarios de los glóbulos rojos, coagulación intravascular diseminada y factores mecánicos y de otro tipo1. La hemólisis in vivo puede tener graves consecuencias para los pacientes, por lo que las pruebas se realizan con el objetivo de distinguir entre hemólisis in vivo e in vitro, ya que cualquier sospecha de origen patológico debe investigarse más a fondo.

Independientemente del origen, la hemólisis es la principal causa de rechazo de muestras en patología clínica humana2 y también es probable que sea un error frecuente en medicina veterinaria3. La hemólisis puede modificar los resultados analíticos mediante la liberación de componentes intracelulares al plasma, la dilución de la muestra o la producción de interferencias espectrofotométricas o químicas4. Los resultados de los análisis de sangre de rutina pueden variar según el grado de hemólisis, la especie animal implicada y el método y el instrumento utilizados en el análisis. Se han notificado errores de cálculo debido a hemólisis para diversos analitos, como alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), g-glutamiltransferasa (GGT), creatina quinasa (CK), lactato deshidrogenasa (LDH), lipasa, bilirrubina total, albúmina, glucosa, creatinina, urea, calcio, cobre, hierro, magnesio, molibdeno, selenio, zinc, potasio, sodio y cloruro5,6,7,8,9,10,11. La magnitud de la diferencia es muy variable, ya que para algunos analitos la relación con el grado de hemólisis es lineal, como ocurre con el hierro, el zinc, el potasio y la bilirrubina, mientras que, por ejemplo, el calcio y el cloruro muestran una relación no lineal, lo que podría conducir a una medición significativa. errores1,7. Además, la hemólisis también puede interferir con inmunoensayos y pruebas de coagulación12,13. Por lo tanto, el control preanalítico de la hemólisis es una buena práctica.

La detección visual es la forma más sencilla de determinar la hemólisis en una muestra, ya que el color varía según el grado de hemólisis. Sin embargo, varios estudios14,15 han demostrado que el examen visual es un medio poco confiable para evaluar la hemólisis y que esta práctica podría afectar las decisiones clínicas16. Por lo tanto, aunque una concentración de hemoglobina libre (Hb) ≥ 0,5 g L–1 se considera clínicamente significativa para la mayoría de los ensayos sensibles a la hemólisis17, algunos investigadores consideran que la detección visual confiable de concentraciones inferiores a 2 g L–1 puede ser difícil18 debido a la variaciones individuales en el color del suero. Por lo tanto, la inspección visual de las muestras podría producir resultados sesgados, y algunos analitos como LDH y AST se verían afectados incluso cuando se detecta una concentración de Hb en suero inferior a 0,5 g L–18. Por estas razones, la cuantificación de la hemólisis es importante para evitar el rechazo innecesario de muestras. Por lo tanto, deben utilizarse mediciones objetivas para determinar si las muestras deben rechazarse o aceptarse sobre la base del umbral de aceptabilidad requerido para cada tipo de análisis. Además, la evaluación de la hemólisis también podría ser útil para indicar la dirección de cualquier sesgo en los parámetros, aunque generalmente se desaconseja el uso de fórmulas correctoras2.

La necesidad de estimar el grado de hemólisis ha llevado a los fabricantes de dispositivos automatizados (particularmente en bioquímica clínica) a desarrollar técnicas basadas en el índice de hemólisis (HI). El HI es una medida relacionada con el color rojo del suero, que es causado casi exclusivamente por la Hb derivada de la ruptura de glóbulos rojos. Sin embargo, el HI se estima de diferentes formas en los distintos dispositivos disponibles, y falta armonización de los métodos utilizados para detectar y cuantificar la hemólisis por los diferentes fabricantes19. Además, es posible que los laboratorios más pequeños y menos equipados y los laboratorios en los que las muestras de sangre se analizan ocasionalmente no cuenten con dispositivos automatizados para medir el HI. Por lo tanto, el objetivo principal del presente estudio fue desarrollar un método simple para cuantificar el grado de hemólisis en muestras de suero en laboratorios donde no se dispone de dispositivos automatizados. Se ensayaron dos métodos diferentes en muestras de suero bovino. El primer método se basa en la medición directa del color del suero por espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-VIS), ya que la mayoría de los laboratorios suelen contar con equipo espectrofotométrico. El segundo método para estimar la hemólisis se basa en datos RGB de imágenes digitales de muestras de suero. La información RGB se extrae de fotografías digitales de las muestras utilizando un software de procesamiento de imágenes gratuito, ya partir de estos datos se realiza la predicción del grado de hemólisis mediante regresión de mínimos cuadrados parciales o una red neuronal artificial. Este sistema de medición de la hemólisis podría ser utilizado potencialmente por pequeños laboratorios de campo donde no se dispone de equipos espectrofotométricos, o por médicos que necesitan determinar la idoneidad y calidad de las muestras de suero antes de enviarlas a un laboratorio especializado, ya que la categorización incorrecta de las muestras es la principal causa de hemólisis en la fase preanalítica1.

La recogida de datos se llevó a cabo de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE relativa a la protección de los animales utilizados con fines científicos20, y el ensayo cumplió con la legislación española sobre cuidado de animales21. Los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Bioética del Hospital Veterinario Docente Rof-Codina, Universidad de Santiago de Compostela (España) (AELU001/21/INVMED(02)/Animal(05)/MM/01). El estudio se informa de acuerdo con las directrices ARRIVE.

Se obtuvo sangre de la vena yugular de diez vacas sanas Holstein-Friesian utilizadas para la enseñanza de métodos de examen clínico y alojadas en el Hospital Veterinario Docente Rof-Codina, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela (España).

Se recogieron tres tipos de muestras de sangre de cada vaca, para obtener suero, preparar el hemolizado y para análisis hematológico. Las muestras de sangre completa recolectadas en tubos de suero de 9 ml (Vacuette®, CAT Serum Clot Activator; Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) se centrifugaron a 1500 g durante 15 min dentro de las 4 h posteriores a la recolección para producir suero. Los tubos de suero se almacenaron a –20 ºC para su posterior análisis. El hemolizado se obtuvo congelando (–20 ºC) muestras de sangre total recogidas en tubos de 9 mL que contenían heparina sódica (Vacuette®, NH heparina sódica, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria). El análisis hematológico se realizó en muestras de sangre total recogidas en tubos de 6 mL que contenían ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Vacuette®, K2E EDTA K2, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria).

Cada muestra de suero se dividió en siete submuestras, a las que se añadieron cantidades crecientes de hemolizado para producir 0,0 %, 0,2 %, 0,5 %, 1,0 %, 2,5 %, 5,0 % y 10 % de hemólisis (Fig. 1). El grado de hemólisis, expresado en gramos de Hb por litro, se calculó a partir de la concentración de Hb de cada muestra de sangre total determinada en un contador de glóbulos automático. La relación entre la concentración de Hb en las muestras, incluidos los puntos individuales superpuestos y el grado de hemólisis en el rango de 0,0 a 10 %, se muestra en un diagrama de caja y bigotes (Fig. 2). La concentración de Hb varía ligeramente con el grado de hemólisis debido a la variabilidad natural en el contenido de Hb y la Hb libre en sangre en los eritrocitos de diferentes individuos. Por lo tanto, se utilizaron un total de 70 muestras de hemólisis graduada en los diferentes métodos propuestos.

Color de las muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de hemoglobina (Hb) (de izquierda a derecha: 0,0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 y 10 g L–1, respectivamente). (Tomada en nuestro laboratorio de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Santiago de Compostela el 24 de mayo de 2022 por C. Herrero Latorre utilizando un Apple Iphone 12).

Diagrama de caja y bigotes de la concentración sérica de hemoglobina (Hb) en relación con el grado de hemólisis de las muestras.

Se utilizó un contador de glóbulos automatizado (ProCyte Dx, IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine, EE. UU.), basado en una combinación de tecnologías de citometría de flujo con láser de fluorescencia y de impedancia de flujo laminar, para producir hemogramas completos. Los parámetros hematológicos fueron normales en todas las vacas22. Las mediciones espectrofotométricas UV-VIS se llevaron a cabo en un espectrofotómetro Thermo Scientific Genesys 6 (Thermo Electron Corporation, Madison, EE. UU.). Las muestras de sangre se centrifugaron en una centrífuga iFuge-D06 (Neuation Technologies, Gujarat, India).

Las imágenes digitales se obtuvieron en un sistema interno descrito en detalle en un artículo anterior23. Brevemente, el sistema comprende una cámara réflex digital (Canon-50D) operada bajo luz controlada emitida por un LED blanco. La cámara estaba equipada con una lente macro Sigma 105 mm f/2.8 y se operaba de forma remota desde una computadora portátil con el software de control proporcionado por el fabricante (EOS Utility 2.14.10). Las imágenes digitales se procesaron para obtener datos RGB con el software ImageJ 1.52a, desarrollado por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (disponible de forma gratuita en http://imagej.nih.gov/ij). Los procedimientos de calibración multivariante de regresión univariada y de mínimos cuadrados parciales y otros cálculos estadísticos se realizaron con Statgraphics Centurion XVIII, versión 18.1.12 (Statistical Graphics, Rockville, Madison, EE. UU.). Las redes neuronales se desarrollaron utilizando WinNN32, versión 1.6a (Y. Danon. Arad, Israel). Otros cálculos estadísticos (como la prueba conjunta de pendiente e intercepción) se realizaron utilizando la biblioteca Ellipse en el entorno de software libre para computación estadística y gráficos R, versión 4.0.5 (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria).

La hemoglobina es la principal molécula intracelular de los glóbulos rojos y, por lo tanto, es el mejor indicador del grado de hemólisis en las muestras de sangre. La concentración de Hb en las muestras de hemólisis graduada se midió mediante el método de la cianometahemoglobina (el método de referencia internacional para medir la concentración de Hb) con un kit de ensayo de laboratorio (Spinreact, Girona, España). Básicamente, la Hb es oxidada por el ferricianuro de potasio en metahemoglobina, que es convertida por el cianuro de potasio en cianometahemoglobina (CNMHb). La intensidad del color formado (medido a 540 nm por espectrofotometría UV-VIS) es directamente proporcional a la concentración de Hb en la muestra. Los resultados obtenidos utilizando los métodos propuestos descritos en las dos secciones siguientes se compararon con los generados por este procedimiento basado en CNMHb.

La hemoglobina se puede estimar mediante la medición espectroscópica directa de muestras de suero a 540 nm, que es uno de los principales picos de absorbancia de este compuesto y sus derivados. En el presente estudio, este método de medición directa se aplicó a diluciones (1:10) de las muestras de hemólisis graduada.

Este método se basa en la información de color proporcionada por imágenes digitales individuales de las muestras. Las muestras de suero hemolizado se colocaron en cubetas de espectrofotómetro (1,75 ml), que se mantuvieron a una distancia fija (15 cm) del plano focal de la cámara. En todos los casos, las imágenes se capturaron con enfoque manual, apuntando al punto central de la cubeta, con los siguientes ajustes: balance de blancos personalizado fijo (5200 K), apertura f2.8, tiempo de exposición 1/10 s y sensibilidad fotográfica 100 ASA. Las imágenes se obtuvieron mediante una operación remota basada en computadora para evitar movimientos no deseados de la cámara, y todas las imágenes se almacenaron directamente en el disco duro de la computadora como archivos jpeg sin comprimir. Experimentos anteriores demostraron que el formato jpeg es preferible a otros formatos como los archivos raw o tiff23. Los histogramas RGB extraídos de los archivos jpeg retuvieron la información de color en archivos más pequeños que los archivos sin procesar o tiff, lo que permitió un manejo más rápido y ocupó mucho menos espacio en disco. Los valores R, G, B y de intensidad ponderada se extrajeron de las fotografías con ImageJ, un programa de procesamiento de imágenes de código abierto diseñado para imágenes multidimensionales. Para cada muestra, los valores RGB, que indican la intensidad de los colores rojo, verde y azul, se extrajeron de cada imagen con el software ImageJ. Cada valor de intensidad se expresa en una escala de 0 a 255 (256 canales), donde los números de canal más altos indican colores más claros. El valor de color, considerado la señal analítica, está relacionado con la concentración de Hb. En el caso que nos ocupa, se ensayaron dos procedimientos de calibración diferentes: i) calibración univariante con cada uno de los valores de R, G, B e intensidad; y ii) calibración multivariante basada en las cuatro variables R, G, B e intensidad conjuntamente por medio de regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR) y red neuronal artificial de alimentación hacia adelante multicapa (MLF-ANN).

Se construyó una matriz de datos (X70x7) a partir de los datos de la muestra. En todos los casos, las filas (70) correspondieron a muestras de suero hemolizado y las columnas (7) a los valores numéricos de las siete variables que caracterizan las muestras: (1) el código de muestra; (2) el valor de Hb determinado por el método CNMHb; (3) la absorbancia de las muestras medida a 540 nm por espectrofotometría UV-VIS; y (4–7) respectivamente los valores de R, G, B y la intensidad ponderada obtenida de las imágenes digitales con el software ImageJ.

La matriz de datos se sometió a diferentes calibraciones quimiométricas univariadas y multivariadas para explorar la relación entre la concentración de Hb y la(s) señal(es) analítica(s) considerada(s). En el método espectrofotométrico UV-VIS directo se realizó calibración univariante para la absorbancia a 540 nm y el valor de Hb determinado por CNMHb. En los procedimientos RGB, se ensayaron tanto la calibración univariante como la multivariante. En el enfoque univariado, los valores de R, G, B y de intensidad ponderada se representaron frente al valor de CNMHb-Hb. Para las calibraciones multivariadas, se consideró un conjunto de cuatro variables predictoras X (R, G, B e intensidad ponderada) y una respuesta Y dependiente (contenido de Hb). Se utilizaron dos enfoques diferentes (PLSR y MLF-ANN) para construir diferentes modelos matemáticos para la predicción. El método PLSR implica derivar la compleja relación entre las variables X y la respuesta Y. Para la predicción (determinada por validación cruzada) se construyó un número limitado de factores latentes (LF) por medio de PLSR. Los LF están asociados con direcciones en el espacio de factores relacionados con una alta variación en la respuesta Y, y están sesgados para obtener la mejor predicción (para una explicación más detallada, ver Geladi y Kowalski24). Por otro lado, MLF-ANN es una poderosa técnica de reconocimiento de patrones que desarrolla modelos sobre la base de un conjunto de muestras de entrada/salida (datos de color RGB y contenido de Hb) actualizando y cambiando los pesos entre las conexiones neuronales para producir una salida adecuada para cada entrada. Por lo tanto, los pesos de las conexiones brindan información útil sobre la relación entre los datos de color de entrada y el contenido de Hb de salida. Sin embargo, esta información no es químicamente interpretable25.

Las estrategias de validación fueron diferentes para los enfoques univariados y multivariados. Para los métodos univariados, el conjunto de 70 muestras se dividió en subconjuntos de calibración (49 muestras: 70 % del total) y validación (21 muestras, 30 %). La asignación de las muestras a cada subconjunto se realizó de forma aleatoria pero considerando las diferentes concentraciones de Hb. Este arreglo muestral proporcionó información suficiente para la construcción de modelos univariados y la validación adecuada con las muestras restantes. Para calibraciones multivariadas (PLSR y MLF-ANN), los modelos deben construirse utilizando la mayor cantidad de información posible y es cierto que la situación óptima sería tener un gran número de muestras que permitiera tener muestras suficientes para establecer dos modelos independientes y grandes conjuntos para el aprendizaje y la validación. En el caso que nos ocupa, debido al número limitado de muestras disponibles, un procedimiento de validación cruzada anidada que produce estimaciones de rendimiento sólidas e imparciales independientemente del tamaño de muestra reducido26. El 90% de las muestras se utilizó para construir el modelo de predicción y el otro 10% se utilizó para la validación. De acuerdo con esta distribución de conjuntos, se llevó a cabo un procedimiento de validación cruzada anidado por diez con diferentes constituciones de conjuntos de entrenamiento y validación asegurando la independencia entre ambos conjuntos y desarrollando un modelo diferente en cada paso. A continuación, se calculó el rendimiento general como una media de los rendimientos de clasificación de los 10 modelos desarrollados por separado en diferentes conjuntos del 10 % de los datos de validación que no participaron en el desarrollo de los modelos26. La precisión se evaluó en términos de ensayos de reproducibilidad intermedia evaluando el coeficiente de variación (CV = SD/\(\stackrel{\mathrm{-}}{\text{x}}\)*100) para diez medidas de réplicas en tres diferentes niveles de concentración (0.5, 2.5 y 10%), preparados con diferentes muestras de suero y medidos por diferentes operadores. La linealidad de la respuesta para todos los métodos desarrollados se probó para un contenido de Hb de hasta el 10 %, y el límite de detección (LOD) se calculó como 3 veces y el LOQ como 10 veces la desviación estándar de los diez (n = 10) sueros en blanco. . La precisión se evaluó comparando las concentraciones de Hb obtenidas por cada método desarrollado con las obtenidas por el método CNMHb.

El estudio se ajusta a las directrices y normativas pertinentes.

Las 49 muestras de calibración se utilizaron para confirmar la relación entre la concentración de Hb y la absorbancia a 540 nm en las muestras de suero bovino. La relación sigue la ley de Lambert-Beer, exhibiendo un modelo lineal descrito por Absorbancia = (0,1051 ± 0,0075) + (0,0873 ± 0,0017) (Hb), con un coeficiente de correlación de 0,991 (Fig. 3a). Este resultado también fue verificado por ANOVA, y se encontró que la relación lineal entre la absorbancia y la Hb era significativa (P < 0,05).

(a) Curva de calibración para la concentración de hemoglobina (Hb) preparada a partir del conjunto de calibración para el método espectrofotométrico UV-VIS directo. (b) Predicción de los niveles de concentración de hemoglobina (Hb) utilizando el método espectrofotométrico UV-VIS directo para las muestras de validación en comparación con los proporcionados por el método CNMHb.

Una vez demostrada la adecuada relación lineal entre la absorbancia y la concentración de Hb en las muestras de suero bovino, se realizaron diferentes estudios para establecer las cifras analíticas de mérito en relación a la exactitud, precisión, linealidad, LOD y límite de cuantificación (LOQ) del método. . La precisión se evaluó mediante la predicción de la concentración de Hb en las 21 muestras conocidas del conjunto de validación. Después de medir la absorbancia a 540 nm en estas muestras, la curva de calibración obtenida se utilizó para predecir la concentración de Hb. La concentración de Hb determinada por UV-VIS se representó frente a la concentración medida mediante el método CNMHb (Fig. 3b). La regresión lineal es probablemente el enfoque más común utilizado para comparar diferentes métodos analíticos. Con base en este enfoque, si los dos métodos ensayados brindan resultados comparables, la línea de regresión entre la prueba y los métodos de referencia debería producir una línea recta que no sea significativamente diferente de la línea de igualdad (caracterizada por una pendiente igual a 1 y una intersección igual a 0). La desviación de la línea de igualdad indica una falta de acuerdo entre los dos métodos. En el caso que nos ocupa, la regresión lineal entre la concentración de Hb determinada por UV-VIS y la concentración arrojada por el método de referencia produjo una línea recta para la cual la ecuación de regresión de mínimos cuadrados es UV-VIS predicha = (0.0816 ± 0.1257) + ( 0,9688 ± 0,034) * (Hb), con un coeficiente de correlación de 0,988. La línea resultante está cerca de la línea de igualdad: los intervalos de confianza del 95 % para la pendiente (0,935–1,0032) y el intercepto (−0,0441–0,2073) incluyen respectivamente los valores 1,0 y 0,0. Por tanto, los resultados proporcionados por la medición UV-VIS son comparables a los producidos por el método CNMHb. Para verificar este resultado se realizó una prueba pareada comparando las concentraciones de Hb obtenidas por los dos métodos. Para las 21 muestras del conjunto de validación, la diferencia media \({\overline{\text{X}}}\)d fue 0,0115 y la desviación estándar de la diferencia Sd fue 0,455. De acuerdo con estos datos, el valor de tcal = (\({\overline{\text{X}}}\)d \(\sqrt{\mathrm{n}}\))/Sd fue 0,116. Como tcal es inferior a t(95 %, n−1), se puede confirmar que el método UV-VIS arrojó resultados de Hb comparables con los obtenidos por el método de referencia CNMHb, con un nivel de significación de 0,05. De hecho, la recuperación media de las muestras de la validación por las determinaciones UV-VIS fue del 93,6% (ver Tabla 1).

En el caso del método RGB, se aplicaron dos enfoques de calibración diferentes: calibración univariante y calibración multivariante. Cuando se probó la calibración univariante para los cuatro parámetros de color extraídos de las imágenes de las muestras en el conjunto de calibración, los valores de G, B y la intensidad no se correlacionaron bien con la concentración de Hb. La única variable de color que mostró una relación lineal con la concentración de Hb fue la variable R (correspondiente a los tonos rojos). Este resultado era el esperado ya que el color de las soluciones de suero se encuentran en el rango rojo (de amarillo-naranja a rojo intenso) (Fig. 1).

Con el objetivo de presentar una curva de calibración utilizando una señal analítica similar a las obtenidas por el método UV-VIS, la señal analítica R bruta se transformó en Redbance (similar a la absorbancia), calculada de la siguiente manera:

donde R es el valor de los datos R extraídos para la muestra considerada y 256 es el número total de canales RGB en el rango rojo. Utilizando esta magnitud para la señal analítica, el Redbance varía entre 0 para soluciones incoloras y 2,4 para las soluciones rojas más oscuras. De acuerdo con esta señal analítica, la relación entre Redbance y la concentración de Hb en muestras de suero bovino siguió una relación lineal, descrita por Redbance = (0,0929 ± 0,0021) + (0,0187 ± 0,0005) (Hb), con un coeficiente de correlación de 0,983. Sin embargo, como se deduce de estos resultados y se ve en la Fig. 4a, los resultados no fueron tan satisfactorios como los resultados UV-VIS, exhibiendo una mayor dispersión de datos para las muestras de calibración. La línea de regresión para la concentración de Hb determinada y el valor de referencia (Fig. 4b) es una línea recta que difiere ligeramente de la línea de igualdad y, de hecho, el intervalo de confianza para la pendiente (0,824-0,914) no incluye un valor de 1.0. Esto conduce a una sobreestimación de las concentraciones de Hb para valores por debajo del 5 % y a una subestimación por valores superiores al 5 %.

(a) Curva de calibración para la concentración de hemoglobina (Hb) preparada a partir del conjunto de calibración para el método univariante RGB (basado en R). (b) Predicción de los niveles de concentración de hemoglobina (Hb) utilizando el método univariante RGB (basado en R) para las muestras de validación en comparación con los proporcionados por el método CNMHb.

En la calibración multivariante, se utilizaron dos procedimientos diferentes para construir el modelo matemático para predecir la concentración de Hb en suero en función de las cuatro variables de color. El primero se basó en la regresión PLS, mientras que el segundo utilizó MLF-ANN.

Se aplicó PLSR a las 70 muestras de matriz de datos con las cuatro variables X (R, G, B e intensidad ponderada) y la respuesta Y (Hb). Se eliminó la división anterior entre conjuntos de calibración y validación porque en el presente caso, se realizó una validación cruzada de diez veces como se describe en la sección de métodos. El modelo se ajustó al conjunto de entrenamiento compuesto por el 90 % de las muestras y se utilizó para predecir el 10 % de las muestras en el conjunto de validación. El proceso debe repetirse 10 veces para garantizar que todas las muestras se incluyan en el conjunto de validación al menos una vez (esta estrategia de validación evidentemente tiene un alto costo computacional; sin embargo, esto no es un problema para los procesadores de computadora actuales y los paquetes quimiométricos modernos que puede automatizar este procedimiento). En el presente estudio, se seleccionó un rango de modelo de tres LF como óptimo, reteniendo el 99,9 y el 98,1% de la varianza X e Y total, respectivamente. La varianza explicada para la respuesta en la predicción fue del 97,6%. Los valores predichos para las muestras de validación en relación con el valor de Hb de referencia se presentan en la Fig. 5. Los resultados son claramente una mejora en el enfoque univariado. La ecuación lineal obtenida fue: PLSR Predicho = (0.051 ± 0.0.069) + (0.9807 ± 0.0170) (Hb), R = 0.990. Si la línea recta obtenida es compatible con la línea de igualdad (con pendiente = 1 e intersección = 0), entonces esto significa que el método RGB-PLSR produce resultados comparables al método de referencia. Se aplicó una prueba basada en la definición de una región de confianza conjunta para el intercepto βo y la pendiente β1 (que es una elipse) para verificar este punto final. En el caso que nos ocupa, la región de confianza del 95 % obtenida incluía valores de βo = 0 y β1 = 1. Luego, con un nivel de confianza del 95 %, el método RGB-PLSR logró resultados compatibles con el método de referencia CNMHb para la medición de hemoglobina. Por lo tanto, las cuatro variables de color juntas contienen suficiente información para predecir adecuadamente la concentración de Hb. En un intento por mejorar la capacidad predictiva de los modelos basados en RGB, se construyó otra calibración multivariante utilizando una red neuronal artificial de alimentación hacia adelante de múltiples capas.

Predicciones de los niveles de concentración de hemoglobina (Hb) utilizando el método RGB-PLSR para las muestras de validación en comparación con las proporcionadas por el método CNMHb.

En esta sección, se utilizó un MLF-ANN para predecir la concentración de Hb sobre la base de los datos sin procesar para las mismas cuatro variables de color. La arquitectura neuronal para la red MLF se seleccionó de la siguiente manera. La capa de entrada estaba compuesta por cuatro neuronas (un número igual al número de variables de color de entrada), y la capa de salida estaba formada por una neurona, arrojando el valor de Hb predicho por la red. El número y el tamaño de las capas ocultas se seleccionaron sobre la base del error cuadrático medio (RSE) mínimo para el conjunto de datos completo. El RSE más bajo se logró usando una red neuronal con tres capas (4–7-1) y se usó para cálculos posteriores. Otras arquitecturas de red con 2 capas ocultas proporcionaron un RSE similar, pero se prefirió la estructura más simple con tres capas. La función de transferencia utilizada para los cálculos de salida fue sigmoidal: f(x) = 1/(1 + [exp(–x)]). Los pesos iniciales de las conexiones entre neuronas se seleccionaron aleatoriamente en el rango de 3 a −3. El parámetro de tasa de aprendizaje adaptativo η y el impulso i (los parámetros que actualizan el peso de las conexiones después de cada época) fueron 0.2 y 0.5 respectivamente, y el El número máximo de épocas se limitó a 500 para evitar el sobreajuste. Para la validación, se aplicó una validación cruzada de diez veces como se describe anteriormente. Las concentraciones séricas de Hb predichas por MLF-ANN se presentan en la Fig. 6. La ANN proporciona incluso mejores resultados que PLSR. La comparación entre los valores predichos de ANN y la concentración de Hb de referencia fue adecuada, siguiendo una línea ajustada predicha por ANN = (0,0270 ± 0,0348) + (0,9916 ± 0,0083) (Hb), con un coeficiente de correlación de 0,997. La compatibilidad con la línea de igualdad se demostró positivamente utilizando la misma prueba que en el apartado anterior. Por lo tanto, la red neuronal optimizada es capaz de extraer información útil de los datos de color sin procesar, prediciendo correctamente la concentración de Hb en las muestras de suero, según lo determinado por el método de referencia CNMHb.

Predicciones de los niveles de concentración de hemoglobina (Hb) utilizando el método RGB-MLF-ANN para las muestras de validación en comparación con las proporcionadas por el método CNMHb.

Además de evaluar la precisión expresada en términos de la capacidad predictiva de los métodos descritos anteriormente, se probaron otras figuras analíticas de mérito, como la precisión en tres niveles de concentración, el LOD y la linealidad. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 1. El método UV-VIS produjo resultados adecuados en relación con el procedimiento CNMHb. Por lo tanto, la medición de la absorbancia a 540 nm es un método rápido y sencillo para estimar la hemólisis en suero bovino. El LOD fue el más bajo de todos los procedimientos desarrollados y la linealidad de la absorbancia relativa a la concentración real de Hb fue de hasta el 10 %. El método univariante RGB, basado en la respuesta en los canales rojos medida como Redbance, produjo resultados insatisfactorios, porque las predicciones para las muestras de validación sobreestimaron el contenido de Hb para valores bajos y subestimaron valores altos. Este método directo univariante basado en el color también produjo malos resultados en cuanto a precisión (especialmente para valores de concentración inferiores al 1%). Así, el enfoque RGB-multivariante mejoró los resultados obtenidos. Las predicciones obtenidas en ambos métodos RGB multivariados basados en calibraciones PLSR y MLF-ANN produjeron resultados similares al método CNMHb. Sin embargo, la precisión de las predicciones por el método PLSR y, en consecuencia, las recuperaciones por este método fueron muy pobres para valores bajos. Por el contrario, la calibración con una red neuronal arrojó resultados adecuados para la precisión, con un CV en el rango de 0,10 a 5,56 %. Además, la respuesta lineal para el método RGB-ANN produjo hasta un 10 % de Hb y la recuperación media en comparación con el método CNMHb fue del 102,3 %.

Se probaron dos métodos basados en el color para determinar la hemólisis en muestras de suero bovino midiendo la concentración de Hb. Tanto el método espectrofotométrico UV-VIS directo como RGB-MLF-ANN produjeron resultados satisfactorios, proporcionando resultados estadísticamente comparables con los obtenidos por el método de referencia CNMHb (P < 0,05). En ambos casos, las cifras de mérito fueron adecuadas y se detectó hemólisis a 0,50 g L–1, el nivel mínimo que suele interferir en los resultados de los análisis de sangre17.

Se han desarrollado muchos métodos para medir la Hb, ya que la Hb se utiliza para indicar anemia y hemólisis in vitro, ambas importantes y frecuentes en la medicina humana. Históricamente, la medición de Hb se ha basado en laboratorios bien equipados y en el uso de procedimientos químicos como el método CNMHb, el método de referencia para determinar las concentraciones de Hb según el Comité Internacional de Normalización en Hematología (ICSH)27. Este enfoque se basa en la medida de la absorbancia a 540 nm del derivado más estable de la Hb, la cianometahemoglobina28. Sin embargo, el ICSH solo recomienda el uso de este método por los comités nacionales para la estandarización de métodos hematológicos o por titulares oficiales designados por el gobierno. El uso de este método en la prueba de hemólisis no es factible ya que requiere mucho tiempo y produce residuos tóxicos. Sin embargo, el método todavía se usa con frecuencia en algunos países29.

Hoy en día los laboratorios de todo el mundo tienen como objetivo la detección sistemática de la hemólisis en las muestras debido a la alta incidencia y trascendencia de este fenómeno en la patología clínica. Dado que el procedimiento está destinado a realizarse en todo tipo de laboratorios, se están desarrollando métodos más rápidos y sencillos para detectar y cuantificar la hemólisis. La espectrometría se considera el mejor método para evaluar la Hb libre y, aunque el uso estándar de HI se propone en múltiples guías2,30, existe la percepción generalizada de que esta recomendación no ha sido completamente evaluada19. El HI calcula el grado de hemólisis midiendo la absorbancia de muestras de suero o plasma en diferentes pares de longitudes de onda (como 570 y 600 nm o 660 y 700 nm), y este método ahora se incorpora en la mayoría de las estaciones de trabajo grandes. Varios métodos espectrométricos utilizan dos o más longitudes de onda en muestras de ictericia o lipémicas para evitar la interferencia observada en los resultados de una sola longitud de onda.

En un estudio clásico, Malinauskas et al.31 utilizaron muestras bovinas para comparar nueve métodos espectrofotométricos diferentes que involucran el uso de dos y tres longitudes de onda combinadas y otros dos métodos químicos para medir la Hb en plasma. Estos autores llegaron a la conclusión de que los métodos espectrométricos eran más seguros, más fáciles y más precisos y exactos que los métodos que implicaban la adición de productos químicos. Estos diferentes enfoques son posibles porque los espectros de absorción de Hb permiten la estimación de Hb en un amplio rango de longitudes de onda, con al menos dos máximos característicos principales en torno a 420 y 540 nm32. El pico de 540 nm fue elegido para diseñar el método espectrofotométrico directo UV-VIS en este estudio porque se han obtenido buenos resultados en otros estudios para evaluar la hemólisis en humanos y otras especies animales7,33,34,35. También se han utilizado otras longitudes de onda cercanas a estos picos principales. En medicina humana, se demostró que un enfoque espectrofotométrico basado en λ = 414 nm para medir niveles bajos de hemólisis en suero es un método confiable para identificar muestras hemolíticas36. En este caso, el método propuesto permitió la detección de 0,004% de hemólisis. Otros autores que han estudiado las posibles variaciones en los picos de absorbancia de la Hb en función de la presión parcial de oxígeno (PO2) concluyen que cuando la PO2 es superior a 100 mmHg, entonces el pico de 576 también puede ser útil37. Solo se encuentran ligeras diferencias en los espectros de absorción de la oxihemoglobina humana y bovina38 y, por lo tanto, la técnica analítica y la longitud de onda utilizadas en estos estudios también deberían ser válidas en pacientes bovinos, como se demuestra para el método UV-VIS presentado aquí. En este primer método, la calibración univariante de la absorbancia a 540 nm vs. En nuestra experiencia, el contenido de Hb fue suficiente para una buena predicción de la hemólisis en las muestras de suero bovino. Sin embargo, algunas debilidades del enfoque de una longitud de onda desarrollado incluyen los siguientes aspectos: (1) la calibración realizada con una sola longitud de onda podría no ser capaz de distinguir si la señal analítica es solo del analito objetivo (Hb en este caso) o de algún interferente presente en la matriz (suero) que puede aumentar o disminuir la señal medida; y (2) la dificultad para realizar mediciones de campo y la posible interferencia del cambio de color del suero en muestras lipémicas e ictéricas. A pesar de estas consideraciones, en base a los resultados obtenidos, se considera adecuado el procedimiento aquí aplicado basado en una sola longitud de onda porque, además de haber sido validado, es una técnica sencilla, rápida, económica, no destructiva y disponible para medir hemólisis en muestras de suero bovino.

Teniendo en cuenta que los métodos espectrofotométricos pueden no ser factibles para profesionales en condiciones de campo o para pequeños laboratorios veterinarios, se desarrolló un segundo método basado en datos RGB extraídos de una imagen digital de muestras obtenidas con un dispositivo digital simple. La implementación de este método en un teléfono móvil u otro dispositivo móvil proporcionaría una herramienta valiosa para los profesionales de campo para verificar la calidad de la muestra antes de enviarla a laboratorios especializados. De los diferentes enfoques evaluados, el método multivariante RGB-MLF-ANN produjo los mejores resultados para la determinación de Hb. Aunque las cifras analíticas de mérito para RGB-MLF-ANN fueron ligeramente inferiores a las obtenidas por el método UV-VIS (menor precisión para hemólisis del 2,5 % y LOD ligeramente superior), los resultados obtenidos por este procedimiento también fueron aceptables y similares a los obtenido por el método CNMHb (P < 0.05). Por lo tanto, el método se puede utilizar para la medición fiable de la hemólisis. Las herramientas comunes, como cámaras digitales y teléfonos, se utilizan cada vez más en el campo científico, ya que estos instrumentos relativamente económicos incluyen el hardware y el software necesarios para tales tareas. Los datos RGB se han utilizado para realizar diversas tareas analíticas, como detectar adulteraciones en vino añejo23 y determinar el contenido de hierro en sangre, vino y agua39. En la ciencia veterinaria, las cámaras que proporcionan datos RGB permiten el desarrollo de métodos para identificar vacas individuales40,41, medir y controlar los latidos del corazón del ganado42, dividir la carne y las vísceras en las aves43 y detectar el deterioro de la pechuga de pollo44, entre otros. En el campo médico, una variedad de dispositivos utilizan espectrometría o datos RGB para determinar la Hb en humanos, tanto en métodos invasivos45,46 como no invasivos47,48,49,50. La mayoría de estos instrumentos y dispositivos se diseñaron para detectar anemia en pacientes humanos, pero también se han aplicado métodos basados en teléfonos RGB para detectar hemólisis in vitro e in vivo51. Archibong et al.52 utilizaron valores RGB para detectar hemólisis in vivo con un método de teléfono móvil, con una precisión de 0,01 g L–1 de Hb en muestras de plasma y un coeficiente de correlación de R2 = 0,9703. Lopes et al.53 desarrollaron un método que involucra visión artificial y redes neuronales (NN). Luego del entrenamiento del NN se determinaron valores de 0,4 g L–1 de Hb. El dispositivo estimó la hemólisis con suficiente precisión para guiar la decisión del laboratorio en la etapa preanalítica del análisis de sangre. El uso de NN proporciona ventajas para la interpretación de datos con respecto a la no linealidad, el aprendizaje supervisado, la adaptabilidad y la información de contexto. Por estas razones, los NN se han utilizado como una herramienta de predicción multivariable para evaluar la hemólisis de la muestra, así como otros enfoques de calibración bien conocidos, como la regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR). Por lo tanto, Kim et al.54 utilizaron satisfactoriamente PLRS para cuantificar los niveles de Hb en sangre mediante un espectro de reflectancia reconstruido a partir de datos RGB obtenidos del tercer ojo de ganado con una cámara con sensor de tres colores. En este estudio, los autores también determinaron las correlaciones solo para el canal R, para la determinación de la Hb en sangre, concluyendo que aunque este canal estaba asociado con la Hb (P = 0,047), el coeficiente de correlación era demasiado bajo. Este hallazgo respalda la idea de que, aunque el canal R puede estar relacionado con el contenido de Hb, se requiere la aplicación de un enfoque multivariante para producir resultados consistentes y sólidos. En el método univariante RGB evaluado aquí, también se exploró el uso del canal R solamente (porque se espera la relación con la Hb debido al color rojo). Sin embargo, aunque los resultados fueron mejores que los obtenidos por Kim et al.54 (R2 = 0,973 para el procedimiento de canal R directo en comparación con R2 = 0,260 para el procedimiento de canal R), la falta de precisión adecuada (con una alta dispersión de datos para muestras de calibración), así como la sobreestimación de las concentraciones de Hb para valores inferiores al 5% y la subestimación para valores superiores al 5% descartan el uso de este método. El enfoque que involucra el uso de una red neuronal multicapa con aprendizaje directo podría usarse para desarrollar nuevos procedimientos basados en cámaras de bajo costo (con una resolución más alta que la utilizada en este trabajo), o incluso aplicaciones de teléfonos móviles para detectar y cuantificar la hemólisis en el ganado. a partir de imágenes digitales. Esto proporcionará a los profesionales veterinarios que trabajan en el campo una herramienta simple, rápida y fácil de usar para la estimación rápida del grado de hemólisis en muestras bovinas.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Descargar referencias

Los autores agradecen al personal del Hospital Veterinario Docente Rof-Codina y RIAIDT-USC, Universidad de Santiago de Compostela, por el uso de las instalaciones clínicas y analíticas.

Departamento de Anatomía, Producción Animal y Ciencias Clínicas Veterinarias, Facultad de Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Terra, 27002, Lugo, España

Belén Larrán, Marta Miranda, Lucas Rigueira & María Luisa Suárez

Veterinary Teaching Hospital "Rof-Codina", Faculty of Veterinary, University of Santiago de Compostela, Campus Terra, 27002, Lugo, Spain

Belén Larrán, Marta Miranda, Lucas Rigueira & María Luisa Suárez

Departamento de Patología Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Terra, 27002, Lugo, España

Marta López-Alonso & Víctor Pereira

Instituto de Investigación en Análisis Químico y Biológico, Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, Facultad de Ciencias, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Terra, 27002, Lugo, España

Carlos Herrero-Latorre

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BL, MLA, MM y CHL concibieron el experimento y BL, MLA, MM, CHL, VP, MLS y LR realizaron el experimento y participaron en la obtención de muestras. Los datos fueron analizados estadísticamente por CHL y el manuscrito fue escrito por BL, MLA y CHL. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Marta Miranda.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Larrán, B., López-Alonso, M., Miranda, M. et al. Medición de la hemólisis en suero bovino mediante métodos basados en imágenes digitales directas UV-VIS y RGB. Informe científico 12, 13523 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17842-4

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Recibido: 21 diciembre 2021

Aceptado: 02 agosto 2022

Publicado: 08 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17842-4

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