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Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2824 (2023) Citar este artículo

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Para estudiar cómo la variación alélica natural explica la variación cuantitativa del sistema de desarrollo, caracterizamos las diferencias naturales en la actividad del nicho de células madre germinales, medida como el tamaño de la zona progenitora (PZ), entre dos aislamientos de Caenorhabditis elegans. El mapeo de ligamiento arrojó loci candidatos en los cromosomas II y V, y encontramos que el aislado con un tamaño de PZ más pequeño alberga una eliminación del promotor de 148 pb en el ligando de Notch, lag-2/Delta, una señal central que promueve el destino de las células madre germinales. Como se predijo, la introducción de esta deleción en el aislamiento con una PZ grande resultó en un tamaño de PZ más pequeño. Inesperadamente, la restauración de la secuencia ancestral eliminada en el aislamiento con una PZ más pequeña no aumentó, sino que redujo aún más el tamaño de la PZ. Estos efectos fenotípicos aparentemente contradictorios se explican por interacciones epistáticas entre el promotor lag-2/Delta, el locus del cromosoma II y loci de fondo adicionales. Estos resultados proporcionan los primeros conocimientos sobre la arquitectura genética cuantitativa que regula un sistema de células madre animales.

El ajuste fino de la proliferación celular es un aspecto fundamental del desarrollo del organismo y la homeostasis tisular, a menudo coordinado por nichos de células madre. Incluso pequeñas perturbaciones en la actividad del nicho de células madre pueden desregular el crecimiento y el mantenimiento de los tejidos y causar patologías1. La disección de los mecanismos genéticos moleculares que regulan la actividad de los nichos de células madre se ha convertido, por lo tanto, en un foco principal de la investigación biológica. Si bien los estudios genéticos del desarrollo de la función de nicho de células madre en animales han desentrañado los mecanismos reguladores moleculares clave subyacentes, sigue sin abordarse en gran medida si la actividad de los sistemas de células madre es modulada por la variación genética que se segrega en las poblaciones naturales. Si existe, ¿cómo contribuye tal variación alélica a la variación en la actividad del nicho de células madre? ¿Los genes conocidos involucrados en la señalización de nicho de células madre albergan esta variación? ¿Y en qué medida puede explicarse la variación natural en la actividad del nicho de células madre por los efectos de variantes genéticas únicas de gran efecto frente a las contribuciones poligénicas de las variantes de pequeño efecto? La mayoría de los rasgos cuantitativos son complejos, involucran una arquitectura poligénica, con variantes genéticas que no solo actúan de manera aditiva sino también interactiva. Dicha epistasis, también denominada interacción gen-gen (G x G), corresponde a interacciones no aditivas entre variantes alélicas en diferentes loci genómicos2. Se ha observado una fuerte poligenicidad y epistasis para la mayoría de los fenotipos cuantitativos en taxones divergentes3,4,5,6,7,8, pero la disección mecanicista detallada de interacciones epistáticas complejas, incluida la epistasis de orden superior donde interactúan tres o más loci, sigue siendo rara9,10 ,11,12,13,14,15. Aunque experimentalmente difícil de caracterizar, los análisis genéticos moleculares y cuantitativos también sugieren que las interacciones epistáticas generalizadas subyacen a los fenotipos de desarrollo15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Sin embargo, hasta el momento, no hay información sobre cómo las interacciones entre los alelos naturales provocan una variación cuantitativa en los sistemas de células madre animales.

Los sistemas de células madre de la línea germinal (GSC, por sus siglas en inglés) son fundamentales para el desarrollo y la reproducción de metazoos, ya que mantienen poblaciones inmortales de células germinales en un estado indiferenciado e integran señales genéticas y ambientales para ajustar la producción de progenitores de células germinales1,25,26. La investigación genética y los estudios comparativos de evo-devo han descubierto una diversidad de sistemas GSC en taxones distantes27,28,29, pero actualmente se desconoce si las actividades de estos sistemas muestran una variación cuantitativa en las poblaciones naturales de la misma especie. El análisis genético genómico y del desarrollo de especies estrechamente relacionadas (p. ej., dentro del género Drosophila o el género de nematodos Caenorhabditis) indica que las características principales, como las vías de señalización molecular clave y las interacciones célula-célula, del nicho de GSC se conservan en gran medida dentro de los géneros30, 31,32,33,34. Sin embargo, los estudios de genética de poblaciones en Drosophila muestran que los genes GSC centrales pueden albergar niveles sorprendentemente altos de variación alélica, incluso dentro de las especies, lo que sugiere que estos genes evolucionan rápidamente y, a menudo, debido a una selección positiva35,36,37. Por lo tanto, a pesar de su importancia en un proceso de desarrollo fundamental, los genes reguladores de los nichos de GSC no parecen estar restringidos evolutivamente. Lo que no está claro es cómo la variación alélica natural observada se traduce en una variación fenotípica, como la actividad de nicho de GSC.

Para estudiar la base genética de la variación cuantitativa natural en la actividad del nicho de GSC, usamos el sistema GSC en C. elegans, que ha servido como un sistema in vivo simple para estudiar la función del nicho de células madre, que involucra un conjunto de vías de señalización molecular bien definidas25 ,38,39. La línea germinal hermafrodita de C. elegans consta de dos brazos simétricos con zonas progenitoras de células germinales distales (PZ), también denominadas zonas mitóticas o proliferativas, que incluyen las células madre, así como las células progenitoras en mitosis y fase S meiótica (Fig. 1a) . Las células germinales se diferencian en progenitores de gametos a través de etapas meióticas a medida que avanzan hacia el extremo proximal del brazo (Fig. 1a, b)25,38. Las señales reguladoras clave son expresadas por la Célula de la punta distal (DTC), una célula gonadal somática que cubre y contacta con las células en la PZ (Fig. 1a). Estas señales son los ligandos Delta/Serrate/LAG-2 (familia DSL), LAG-2 y APX-1, que activan los receptores Notch (GLP-1) en las células germinales distales, promoviendo el destino de las células madre e inhibiendo la entrada en la meiosis40 ,41,42,43,44,45,46. El CDT constituye así un nicho de células madre25. La señalización de GLP-1/Notch es necesaria y suficiente para el mantenimiento del conjunto de células madre germinales25,39. Las células germinales entran progresivamente en meiosis a medida que se mueven proximalmente y pierden contacto con el DTC. Esto está controlado por una red de proteínas reguladoras de ARN, incluidas las proteínas de unión a ARN PUF (Pumilio y FBF) que promueven la autorrenovación aguas abajo de GLP-1/Notch y otras proteínas reguladoras de ARN (GLD-1, GLD-2, SCFPROM-1 ) que promueven la entrada en meiosis25,38,39,47,48,49. Las señales adicionales de las células de la vaina gonadal modulan aún más la proliferación y diferenciación de las células germinales de C. elegans50,51,52,53,54,55,56. El número de células de la línea germinal PZ está determinado por la interacción de la actividad proliferativa distal y la transición espacio-temporal al estado meiótico proximal. Además, la actividad proliferativa de la línea germinal de C. elegans es muy sensible a la variación en la fisiología y el entorno externo, y difiere en respuesta a la calidad y cantidad de nutrientes, la temperatura o el entorno social25,32,57,58,59,60,61. La variación ambiental modula la proliferación de GSC a través de vías de señalización metabólica y sensorial (p. ej., TGF-β, TOR, AMPK e insulina), que actúan de forma dependiente e independiente de la señalización de Delta/Notch mediada por nicho62,63,64,65,66,67, 68. El sistema de células madre germinales de C. elegans es, por lo tanto, muy plástico, capaz de ajustar su actividad en respuesta a cambios ambientales sutiles. No se sabe si la variación genética natural puede modular de manera similar la actividad de este sistema de células madre. Sin embargo, informes anteriores sugieren que el tamaño del conjunto de progenitores de la línea germinal varía no solo entre las diferentes especies de Caenorhabditis, sino también entre los distintos aislamientos silvestres de C. elegans32,69.

a La zona progenitora de la línea germinal (PZ), ubicada en el extremo distal de cada brazo gonadal, contiene células madre y progenitoras en división mitótica. El grupo de células madre germinales (GSC) se mantiene a través de la señalización Delta/Notch por parte de la célula somática de la punta distal (DTC), que envuelve las células PZ distales. Los ligandos Delta/Serrate/LAG-2 (familia DSL), LAG-2 y APX-1, activan Notch (GLP-1) en las células germinales para promover la proliferación y al mismo tiempo prevenir la entrada meiótica. Las células germinales se diferencian en progenitores de gametos a través de etapas meióticas a medida que avanzan hacia el extremo proximal del brazo. b El tamaño de PZ se usó como un proxy para el número de celda de PZ. Los gusanos de montaje completo teñidos con DAPI se tomaron imágenes bajo epifluorescencia. El límite de la PZ (línea de puntos) se identificó como se describió anteriormente en función de la forma de los núcleos de las células germinales38. b' La región PZ se recortó manualmente de otros tejidos en ImageJ. b" La región PZ se segmentó del fondo usando un umbral de fluorescencia. El área PZ se midió en píxeles. Barras de escala de 20 μm. c El área PZ (escalada al tamaño PZ: μm2/1000) medida de esta manera se correlaciona bien con PZ contada a mano número de celda. Los datos se obtuvieron de las mediciones de los dos aislados JU1200 y JU751 en dos etapas adultas: mid-L4 + 24 h y adulto joven + 24 h. Cada punto de datos representa un individuo (modelo lineal adj R2 = 0.758, p < 2.2 E-16, n = 87); el experimento se repitió dos veces con resultados similares. d Tamaño de PZ (μm2/1000) en adultos jóvenes hermafroditas (1-10 huevos en el útero) de aislamientos silvestres seleccionados de C. elegans y C. briggsae Las barras transversales y las barras de error representan medias marginales estimadas ± errores estándar derivados de un modelo lineal generalizado Las letras minúsculas indican contrastes por pares significativos (p < 0,05) ajustados por Tukey: los aislamientos que comparten las mismas letras no exhiben una diferencia significativa en el tamaño de la PZ Los valores n en dos bloques se indican sobre el eje x. e Orígenes geográficos de los aislamientos silvestres examinados; mapas producidos utilizando los paquetes de R rnaturalearth y rnaturalearthdata v. 0.1.0112 y rgeos v. 0.5-9113. Para obtener datos y resultados estadísticos, consulte las Notas complementarias 1 y 2 y el archivo de datos de origen.

En este estudio, nuestro objetivo fue cuantificar y caracterizar genéticamente la variación natural en la actividad del nicho de células madre germinales de C. elegans. Mostramos que el tamaño de la zona progenitora (PZ) de la línea germinal, aquí, un indicador indirecto de la actividad del nicho de células madre germinales, difiere entre aislados silvestres genética y geográficamente distintos en condiciones de laboratorio estándar idénticas. Usamos un enfoque de mapeo de ligamiento para identificar regiones genómicas asociadas con la variación natural en el tamaño de la PZ, concentrándonos en dos aislados silvestres con diferencias pronunciadas en el tamaño de la PZ. El mapeo genético reveló cuatro QTL candidatos, incluidos dos loci de gran efecto en los cromosomas II y V que actúan de manera aditiva para explicar ~32 % de la variación en el tamaño de la PZ entre las líneas de nuestro panel de mapeo. Descubrimos que la región QTL en el cromosoma V alberga una variante INDEL en la región promotora del ligando lag-2 de DSL, lo que contribuye causalmente a la variación en el tamaño de PZ. Sin embargo, también descubrimos que los efectos fenotípicos de esta variante están fuertemente modulados a través de interacciones epistáticas con el QTL en el cromosoma II y loci genómicos desconocidos adicionales. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que las interacciones epistáticas complejas contribuyen de manera importante a la variación natural en la actividad del nicho de células madre germinales y brindan información preliminar sobre la arquitectura genética cuantitativa de un sistema de células madre animales.

En condiciones estándar de laboratorio, la zona progenitora de la línea germinal hermafrodita (PZ) de la cepa de C. elegans de tipo salvaje de referencia (N2) normalmente contiene ~250 células durante la edad adulta temprana25. La obtención de imágenes de toda la PZ y el recuento del número total de células germinales requiere mucho tiempo y es ineficaz para la detección de un gran número de cepas. Para cuantificar las diferencias naturales en el tamaño de la PZ entre múltiples aislamientos silvestres de Caenorhabditis, primero desarrollamos un método para aproximar el tamaño de la PZ mediante la cuantificación del área transversal de la PZ en una sola imagen fluorescente de una gónada teñida con DAPI de montaje completo (Fig. 1b). Las mediciones de PZ derivadas de este método se correlacionaron bien con los recuentos individuales de núcleos de PZ de pilas de imágenes a través de todo el PZ (adj. R2 = 0.758, p < 2.2E-16) (Fig. 1c, Nota complementaria 1). Examinamos varios aislamientos silvestres de C. elegans y C. briggsae de todo el mundo y descubrimos una variación inter e intraespecífica significativa en el tamaño de PZ cuando se mide en condiciones de laboratorio estándar (Fig. 1d, Nota complementaria 2). La heredabilidad en sentido amplio del tamaño de PZ de adultos jóvenes en el conjunto de datos se estimó en 28% (Nota complementaria 2d).

Entre los aislamientos silvestres examinados, JU1200 (Escocia) y JU751 (Francia) exhibieron diferencias significativas y altamente reproducibles. JU1200 muestra una gran similitud genética con la cepa de referencia de laboratorio N270. Como hermafroditas adultos jóvenes, JU1200 exhibió consistentemente más células progenitoras que JU751 (Fig. 1d). Analizamos el número de células PZ en estos dos aislamientos desde las etapas larvales tardías hasta las etapas adultas reproductivas. Si bien el número de células PZ no difirió en la etapa media de L4, JU751 mostró un número de células PZ significativamente reducido en relación con JU1200 en dos etapas de la edad adulta temprana (Fig. 2a, Nota complementaria 3).

a Número de núcleos de PZ en cuatro etapas de desarrollo: larva L4 media (mL4), adulto joven (YA) con 1-10 huevos en el útero, adulto a las 24 horas después de L4 media (mL4 + 24 h) y adulto a las 24 horas post-adulto joven (YA + 24 h). Los núcleos se contaron en pilas z de gónadas teñidas con DAPI extruidas. Las letras minúsculas indican contrastes significativos por pares ajustados por Tukey (p < 0,05), de modo que los grupos que comparten las mismas letras no son significativamente diferentes. Las barras cruzadas y las barras de error representan medias marginales estimadas ± errores estándar derivados de un modelo lineal generalizado. Los valores n para cada cepa y etapa se indican debajo del eje x (JU1200=rojo, JU751=azul) b Número de núcleos EdU+ (positivos) en la PZ después de un pulso de 15 minutos de EdU en la etapa L4 media ( ***p = 0,00005, contraste por pares ajustado por Tukey). Los valores n se indican debajo del eje x. Las barras cruzadas y las barras de error representan medias marginales estimadas ± errores estándar derivados de un modelo lineal generalizado. c Imágenes representativas de la PZ en gusanos teñidos con DAPI de montaje completo a mL4 + 24 h. Barras de escala: 20 μm. d Imágenes representativas de la tinción de EdU en la etapa media de L4. Las líneas punteadas marcan el límite proximal de la PZ. Barras de escala: 20 μm. Los datos se muestran de un solo (de dos) bloques experimentales. Para obtener datos y resultados estadísticos, consulte las Notas complementarias 3 y 4 y el archivo de datos de origen.

Dado que el tamaño de la PZ no solo puede verse afectado por la actividad proliferativa sino también por la tasa de transición hacia el destino meiótico, analizamos la actividad mitótica utilizando un pulso EdU (5-etinil-2-desoxiuridina) de 15 minutos para etiquetar y cuantificar directamente la proliferación en la PZ antes de la etapa adulta. A mediados de la etapa L4, cuando el número de células PZ en JU751 y JU1200 no fue significativamente diferente (Fig. 2a), JU751 exhibió recuentos significativamente reducidos de células positivas para EdU y, por lo tanto, una actividad proliferativa de células germinales más baja que JU1200 (Fig. 2b, Nota complementaria 4). Las diferencias en la proliferación de células germinales contribuyen así a la diferencia observada en el tamaño de PZ entre JU751 y JU1200.

Para caracterizar la arquitectura genética que subyace a las diferencias observadas en el tamaño de PZ entre JU751 y JU1200, realizamos un mapeo de ligamiento de locus de rasgos cuantitativos (QTL) utilizando líneas consanguíneas recombinantes (RIL) F2 existentes derivadas de estos dos aislados (Fig. 3a, b)71. Los RIL se construyeron mediante la autofecundación de hermafroditas F1 a partir de cruces parentales recíprocos y la consanguinidad de las líneas F2 durante doce generaciones para producir un panel de líneas homocigóticas en cada locus para uno de los dos genotipos parentales (Fig. 3b)71. Medimos el tamaño de PZ de hermafroditas adultos jóvenes (1-10 huevos en el útero) en 70 RIL y mapeamos las diferencias fenotípicas en un mapa genético derivado de las frecuencias de recombinación de 140 marcadores SNP en todo el genoma (Fig. 3a, Fig. 1 complementaria ). El tamaño de PZ varió continuamente entre los RIL y mostró una segregación transgresiva (es decir, fenotipos extremos que excedían los fenotipos parentales) (Fig. 3a). Por lo tanto, empleamos un enfoque de modelado de múltiples QTL usando el paquete R, R/qtl72. Como primer paso, realizamos un solo escaneo QTL, un algoritmo que calcula la probabilidad de que el genotipo en cualquier locus único pueda explicar los datos del fenotipo. Este escaneo reveló un locus de gran efecto en el centro del cromosoma II (QII) con un intervalo de 1.5 LOD de ~ 7.25 Mb (Fig. 3c, línea verde). Luego, usamos un algoritmo de dos QTL para determinar la probabilidad de que cualquier par de loci esté asociado con el fenotipo. Es importante destacar que este algoritmo no permite que los loci tengan efectos opuestos. La exploración de dos QTL reveló un locus adicional (QV) en el brazo izquierdo del cromosoma V (~ 2.6 Mb) que actúa de manera aditiva con el QTL QII en el cromosoma II (Fig. 3d-f). El mapeo de QTL único con el QTL QII como una covariable aditiva también reveló el QTL QV en el cromosoma V (Fig. 3c, línea magenta). Un escaneo adicional de dos QTL, que permitió específicamente las interacciones entre loci con efectos opuestos, reveló dos QTL potenciales más en los cromosomas I (QI, ~ 1 Mb) y X (QX, ~ 2.7 Mb) (Fig. 3g-i). Luego realizamos la selección del modelo multi-QTL, utilizando estos cuatro loci como candidatos. Realizamos la selección del modelo manualmente y también utilizamos una herramienta de poda y creación de modelos proporcionada en R/qtl. Este algoritmo comienza de forma ingenua o con un modelo específico, añadiendo loci a través de sucesivos escaneos del genoma y asignando a cada modelo una puntuación LOD penalizada. Luego, recorta el modelo para lograr la forma más simple con la puntuación LOD penalizada más alta (LOD > 0 indica que el modelo funciona mejor que un modelo con cero QTL). En la Fig. 3j se muestra un conjunto representativo de todos los modelos probados, junto con sus puntajes LOD penalizados. Usamos ambos enfoques y determinamos que nuestros datos RIL respaldan mejor un modelo en el que QII y QV actúan de manera aditiva para determinar el tamaño de PZ. Este modelo explicó ~ 32% de la variación fenotípica en los datos RIL (Nota complementaria 6).

a Estimaciones del tamaño de PZ (corregidas) en F2 RIL (n = 70, analizadas en seis bloques experimentales) y líneas parentales, JU1200 (rojo) y JU751 (azul) (consulte la Nota complementaria 5 para obtener más detalles). b Generación y análisis de F2 RILs. Línea punteada: QTL hipotético. c Los escaneos de un solo QTL identifican dos QTL (QII y QV). Líneas horizontales: umbral LOD basado en pruebas de permutación. eje x: mapa genético de cada cromosoma. Línea verde: resultados de escaneo ingenuos. Línea magenta: resultados de un escaneo donde el marcador M13 (pico, curva magenta) se incluye como covariable. d Resultados de exploración de dos QTL. Mitad superior: puntuaciones LOD (LODa) que comparan el modelo aditivo con el modelo nulo. Mitad inferior: puntajes LOD que comparan el modelo aditivo con el de QTL único (LODav1). Las puntuaciones de LODav1 por encima del umbral (blanco, determinado por pruebas de permutación) indican una mejora en el ajuste con respecto al modelo de QTL único. e Gráfica de interacción para marcadores en el pico en el panel D, mitad inferior (chr V, M1; chr II, M14). f Ubicaciones y tamaños aproximados de los QTL en II y V. g Exploración de dos QTL que permite efectos opuestos. Mitad superior: puntajes LOD (LODi) que comparan un modelo completo de dos QTL con el modelo aditivo. Mitad inferior: puntajes LOD que comparan el modelo completo (permitiendo interacciones) con el modelo de QTL único (LODfv1). Las puntuaciones de LODi por encima del umbral (blanco) indican evidencia de una interacción, mientras que las puntuaciones de LODfv1 por encima del umbral indican una mejora en el ajuste con respecto al modelo de QTL único. h Gráfica de interacción para marcadores en el pico significativo en la mitad superior del panel G (chr I, M14 y chr X, M2). i Ubicaciones y tamaños aproximados de los QTL candidatos en los cromosomas I y X. j Representación de la selección del modelo multi-QTL. Los nodos representan el QTL candidato (QII = chrII@35 cM, QV = chr V@0 cM, QI = chrI@23 cM, QXa = chrX@16 cM, QXb = [email protected] cM) y los radios representan interacciones. Las puntuaciones LOD penalizadas (debajo de cada modelo) por encima de cero indican un mejor rendimiento que el nulo global (cero QTL). Consulte Métodos, Fig. 1 complementaria y Nota complementaria 6 para obtener más detalles. Los ejes Y en los paneles a, e y h están escalados a μm2/1000 (0,1008 μm2/píxel). Los datos se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para validar el efecto del cromosoma II QTL (QII) en el tamaño de PZ, generamos líneas casi isogénicas (NIL). Dos RIL que contenían la secuencia JU751 en QII se retrocruzaron durante 10 generaciones con JU1200 para producir dos NIL que contenían la secuencia JU1200 en varios segmentos del QTL (Fig. 4a). Dos RIL que contenían la secuencia JU1200 en QII se retrocruzaron durante 10 generaciones con JU751 para producir cinco NIL que contenían la secuencia JU1200 en varios segmentos del QTL (Fig. 4b). Los NIL se generaron seleccionando la presencia de productos de PCR específicos de los padres en la región QTL. Ensayamos el tamaño de la PZ varias veces en cada uno de los NIL. Los NIL establecidos en el fondo JU1200 mostraron efectos sutiles en el tamaño de PZ, que no siempre fueron consistentes en los ensayos experimentales (bloques). Por lo tanto, analizamos los resultados agregados obtenidos de nueve bloques utilizando modelos lineales generalizados para tener en cuenta el efecto de bloque experimental y descubrimos que podíamos detectar una reducción pequeña, pero significativa, en el tamaño de PZ (Fig. 4c, Nota complementaria 7). Los NIL en el fondo JU751 mostraron diferencias más grandes y consistentes en el tamaño de PZ, lo que confirma el efecto de QII en el tamaño de PZ (Fig. 4d, Nota complementaria 8). Además, los eventos de recombinación que ocurrieron durante el procedimiento de retrocruzamiento nos permitieron reducir la región QTL de 7,25 Mb a 2,04 Mb (Fig. 4b). La búsqueda de polimorfismos JU751-JU1200 en esta región genómica reducida descubrió un total de ~1024 variantes (incluidas 196 variantes potenciales de alto impacto, es decir, variantes predichas por un algoritmo BCSQ para alterar probablemente la función del gen, por ejemplo, a través de cambios de marco o mutaciones sin sentido) en 250 genes distintos y 10 INDEL grandes70 (ver Datos de origen para más detalles). Sin embargo, no identificamos ninguna variante candidata sólida para un análisis posterior.

a Generación de líneas casi isogénicas (NIL) en el fondo JU1200. Diagrama que muestra el intervalo QTL QII original de ~7,25 Mb en el cromosoma II, con la línea vertical discontinua que indica la ubicación aproximada del pico LOD. Dos RIL, RIL54 (cepa NIC654) y RIL127 (cepa NIC727), que contenían la secuencia JU751 en QII, se retrocruzaron durante 10 generaciones con JU1200 para producir dos NIL (cepas NIC1697 y NIC1701). Azul: genotipo JU751, rojo: genotipo JU1200. b Generación de NILs en el fondo JU751. Diagrama que muestra el intervalo QII original de ~7,25 Mb en el cromosoma II, con la línea vertical discontinua que indica la ubicación aproximada del pico LOD del QTL original. Dos RIL, RIL128 (cepa NIC728) y RIL71 (cepa NIC671), que contenían la secuencia JU1200 en QII, se retrocruzaron durante 10 generaciones con JU751 para producir cinco NIL (cepas NIC1671, NIC1672, NIC1673, NIC1675 y NIC1676). Azul: genotipo JU751, rojo: genotipo JU1200. c Mediciones de tamaño de PZ en NIL establecidas en el fondo JU1200 que se muestra en el panel a y los aislamientos parentales. Los valores n se muestran encima del eje x. Se analizaron los datos de nueve bloques experimentales. d Mediciones de tamaño de PZ en NIL establecidas en el fondo JU751 que se muestra en el panel b y los aislamientos parentales. Los valores n se muestran encima del eje x. Los datos se muestran a partir de un solo bloque experimental (de nueve). El intervalo QII reducido se determinó preguntando si cada NIL mostraba un aumento significativo en el tamaño de PZ en comparación con JU751. Todos los NIL excepto NIC1676 tenían PZ más grandes que JU751. Por lo tanto, la región sobre la que se superpone el segmento JU1200 en estos NIL se consideró el intervalo QTL reducido (2,04 Mb). Los análisis de los datos que se muestran en los paneles c y d se realizaron en datos sin procesar (área PZ en píxeles), y los ejes y se escalaron a μm2/1000 para la presentación (0,0504 μm2/píxel). Las barras cruzadas y las barras de error representan medias marginales estimadas ± errores estándar derivados de modelos lineales generalizados. Los valores de p se derivan de los contrastes por pares ajustados por Tukey. Para obtener datos y resultados estadísticos, consulte las Notas complementarias 7 y 8 y el archivo de datos de origen.

La región de 2,6 Mb de QV contenía solo 21 presuntas variantes candidatas (SNP e INDELS) que contribuyen a las diferencias de tamaño de PZ entre JU751 y JU1200. La inspección detallada de estas variantes reveló un candidato importante: una deleción en JU751 aguas arriba de la región genómica que codifica el ligando tipo delta, lag-2, un regulador primario de la proliferación y diferenciación de células germinales en la vía Notch25,70. Llamamos a esta eliminación lag-2 (cgb1007); los genotipos con esta eliminación se abrevian de aquí en adelante como lag-2p(-), mientras que los genotipos sin esta eliminación se denominan lag-2p(+). Esta eliminación abarca 148 pb y está ubicada en la región del promotor lag-2, 2441 pb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción (Fig. 5a y Fig. 2 complementaria). La región promotora corriente arriba de 3,3 kb de lag-2 contiene seis sitios de unión a HLH-2 (cajas E), que son necesarios para una transcripción robusta de lag-2 en el DTC30,73. La deleción lag-2 (cgb1007) contiene uno de estos sitios de unión de HLH-2 conservados, así como la mayor parte de una repetición poli (G) de 30 pb (Fig. 5a, Fig. 2 y 3 complementarias). Esta eliminación podría explicar la reducción de la proliferación de células germinales observada en JU751 debido a la reducción de la transcripción de lag-2 a través de la pérdida de un sitio de unión específico para el factor de transcripción HLH-273.

un diagrama del QV QTL (barra negra) y una región de 5 kb dentro de él que contiene el gen lag-2 y su secuencia ascendente de 3 kb. El promotor lag-2 bien caracterizado contiene varios sitios de unión a factores de transcripción conocidos, incluidas seis cajas E de HLH-2 (azul oscuro)115. JU751 tiene una deleción de 148 pb (rojo) que se superpone al tercer sitio de unión de HLH-2 y la mayor parte de una repetición poliG de 30 pb (naranja). Las ubicaciones de todos los elementos promotores y las estadísticas de UCSC phastCons (verde) se tomaron de la herramienta JBrowse de wormbase.org (versión WS283)115. b El tamaño de la PZ (μm2/1000) en los padres y las líneas de reemplazo alélicas (ARL) en la etapa de adulto joven. Las barras cruzadas y las barras de error representan medias marginales estimadas ± errores estándar de un modelo lineal generalizado. Los valores n en dos bloques se muestran encima del eje x. El análisis se llevó a cabo en datos sin procesar (área PZ en píxeles) y los ejes Y se escalaron a μm2/1000 para la presentación (0,0504 μm2/píxel). c Imágenes representativas utilizadas para la cuantificación smFISH de transcripciones de lag-2 en el DTC a mediados de L3 (verde de ARNm de lag-2, DAPI [ADN] blanco, barras de escala de 10 μm). El brazo de la gónada está delimitado por una línea discontinua. La flecha marca el DTC. c' Mayor aumento del área de DTC de c. La flecha indica el DTC. Las puntas de flecha indican puntos individuales, que se cuantificaron para determinar los niveles de expresión de lag-2. d – f Cuantificación de lag-2 mRNA puncta a través de smFISH. Las barras cruzadas y las barras de error representan medias marginales estimadas ± errores estándar de un solo modelo lineal generalizado. Para todos los genotipos, n = 19 o 20 por etapa. Los datos de un solo experimento se dividieron en tres gráficos para mayor claridad. Los grupos con diferentes letras minúsculas son significativamente diferentes (p < 0,05) según los contrastes por pares ajustados por Tukey. Para obtener datos y resultados estadísticos, consulte las Notas complementarias 9 y 10 y el archivo de datos de origen.

Al examinar los datos de la secuencia del genoma completo de un panel global de más de 1500 aislados silvestres de C. elegans70,74, encontramos que la eliminación de lag-2 (cgb1007) es exclusiva del aislado JU751. Se encontró una deleción similar, pero más grande, en la región del promotor lag-2 en dos aislamientos de Asia, GXW1 y JU4073 (Figuras complementarias 3c, d). Dado que no se encontraron otros aislamientos que portaran la deleción lag-2 (cgb1007), nos preguntamos si esta deleción podría haber surgido después del aislamiento, durante el cultivo de laboratorio. Por lo tanto, examinamos aislamientos adicionales (para los que no existen datos de la secuencia del genoma completo) que se recolectaron del mismo hábitat (compost) y ubicación (Le Perreux-sur-Marne, Francia) que JU751 en 2004 y 200575. Todos los demás aislamientos (n = 5) que se recolectaron junto con JU751 de esta localidad el mismo día compartieron un haplotipo muy similar y también portaron la deleción lag-2 (cgb1007). En contraste, todos los aislamientos examinados con diferentes haplotipos, recolectados en otras fechas a lo largo de 2004 y 2005 (n = 13) no portaban la deleción71 (Figura 3 complementaria). Llegamos a la conclusión de que la deleción lag-2 (cgb1007) se adquirió antes del aislamiento en el laboratorio y que este alelo es probablemente raro en las poblaciones naturales.

Para validar que la región genómica lag-2 (cgb1007) contribuye a las diferencias en el tamaño de PZ de la línea germinal entre JU751 y JU1200, creamos líneas de reemplazo alélicas recíprocas (ARL) utilizando la edición del genoma CRISPR-Cas9. Primero, introdujimos la eliminación lag-2 (cgb1007) en JU1200, lo que resultó en la cepa JU1200lag-2p (-). En segundo lugar, restauramos la región promotora lag-2 eliminada en JU751, lo que resultó en la cepa JU751lag-2p(+). Como se predijo, la eliminación del fragmento de 148 pb en el fondo JU1200 redujo considerablemente el tamaño de PZ (Fig. 5b). En contraste, y contrariamente a las expectativas, la restauración del fragmento correspondiente en el fondo JU751 no aumentó sino que redujo aún más el tamaño de PZ (Fig. 5b, Nota complementaria 9). Aunque la deleción lag-2 (cgb1007) es suficiente para disminuir el tamaño de PZ en una medida similar a la de JU751 cuando se introdujo en el fondo JU1200, no puede ser la única variante genética que contribuya a la diferencia de tamaño de PZ observada entre JU751 y JU1200. En otras palabras, los efectos de la deleción lag-2 (cgb1007) dependen en gran medida de los antecedentes genéticos. Esto está en línea con nuestro análisis QTL, en el que el efecto marginal del QV QTL solo fue detectable cuando se tuvo en cuenta la variación en el QTL QII (Fig. 3c). Además, mientras que lag-2 (cgb1007) tiene efectos claros en el tamaño de PZ y, por lo tanto, contribuye al efecto general de QV, no podemos descartar otras variantes causales dentro de la región QTL de QV.

Dado el resultado anterior, a continuación queríamos determinar directamente si las diferencias genotípicas observadas en el tamaño de PZ pueden explicarse por las diferencias en la expresión de lag-2 y cómo. Usando hibridación in situ con fluorescencia de molécula única (smFISH)76,77, cuantificamos las transcripciones de lag-2 en los DTC de los aislamientos parentales y los ARL recíprocos, JU1200lag-2p(-) y JU751lag-2p(+). Primero medimos la expresión de lag-2 en aislamientos parentales y descubrimos que la expresión era considerablemente más alta durante el desarrollo larvario que en la etapa adulta, con la expresión más fuerte durante la etapa L3 temprana (Fig. 4 complementaria, Nota complementaria 12). Al cuantificar la expresión de lag-2 en aislamientos parentales y ARL recíprocos en tres etapas larvales, encontramos que en la etapa temprana de L3 (pero no a mediados de L2 o a mediados de L4), JU1200 mostró una expresión de lag-2 significativamente mayor en relación con JU751 ( Fig. 5d, Nota complementaria 10), consistente con su tamaño PZ más grande. Sorprendentemente, la expresión relativamente más alta de lag-2 en JU1200 en la etapa L3 se eliminó por completo en JU1200lag-2p (-), que mostró niveles de expresión muy similares a los de JU751 en las tres etapas de desarrollo (Fig. 5e, Nota complementaria 10). Estos resultados son consistentes con resultados anteriores que muestran que las E-boxes del promotor lag-2 son necesarias para una expresión robusta del transgén lag-2::GFP durante la etapa L373. La inserción de la secuencia del promotor de lag-2 de 148 pb en el fondo JU751 no dio como resultado una mayor expresión de lag-2 en L3 en relación con JU751. En cambio, la expresión de lag-2 en JU751lag-2p (+) fue menor en L3 con tendencias similares en los cambios de expresión entre las etapas (Fig. 5f, Nota complementaria 10). Este resultado confirmó que la reducción inesperada en el tamaño de PZ de JU751lag-2p(+) está causalmente relacionada con la expresión reducida de lag-2. En general, estas mediciones de smFISH muestran que la expresión de lag-2 (en la etapa L3) recapitula estrechamente las diferencias fenotípicas observadas en el tamaño de la PZ en la etapa adulta temprana y confirma que los efectos de la eliminación de lag-2 (cgb1007) dependen en gran medida de la genética. fondo. El análisis de los aislados parentales también muestra que las diferencias naturales en la actividad de nicho de células madre germinales de C. elegans pueden vincularse directamente con las diferencias en la expresión de un componente central de señalización, el ligando lag-2 de Notch.

Dadas las aparentes interacciones epistáticas entre la variante del promotor lag-2 y los antecedentes genéticos, construimos un modelo más exhaustivo para tener en cuenta las interacciones adicionales de dos y tres vías entre 1) porciones centrales del cromosoma II QTL aislado en nuestros NIL (abreviado C2 para distinguirlo del QTL QII completo, con genotipos C2-JU1200 o C2-JU751), 2) la variante del promotor lag-2 (abreviada C5, con genotipos lag-2p(+) o lag-2p(-)), y 3) los antecedentes genéticos (BGND—JU1200 o JU751). Para hacer esto, generamos un gran conjunto de datos que contenía las ocho combinaciones de genotipos posibles (etiquetadas de i a viii) (Fig. 6a). El análisis de este conjunto de datos reveló interacciones sutiles y dramáticas de dos y tres vías (Fig. 6b-e). Para explorar estos datos en detalle, construimos un modelo lineal generalizado, utilizando una estrategia de selección de modelos de arriba hacia abajo para optimizar el criterio de información bayesiano (BIC) y la desviación ajustada contabilizada en el modelo (D2)78 (Nota complementaria 11). El modelo optimizado indicó que el tamaño de la ZP se explica mejor por los tres efectos principales y todas sus interacciones (es decir, completamente cruzada). Además, el modelo incluye un efecto de bloque principal fijo e interacciones para tener en cuenta la variación entre diferentes bloques experimentales. El modelo representa el 33,4% de la desviación ajustada (D2) y se ajusta bien a los datos (desviación residual = 2796,5 en 2763 df; Pχ2 = 0,324) (Nota complementaria 11).

un esquema que representa la generación de los ocho genotipos utilizados en el análisis de interacciones. Los diferentes genotipos se derivaron creando o reemplazando la deleción lag-2 (cgb1007) en los NIL de fondo JU1200 y JU751. Luego, las líneas modificadas con éxito se retrocruzaron con las líneas parentales para aislar las modificaciones CRISPR en los antecedentes parentales. Los genotipos están etiquetados i-viii para mayor claridad. b Medias marginales estimadas ± errores estándar del tamaño de la ZP a partir de un modelo lineal generalizado que describe un conjunto de datos que contiene los ocho genotipos. Los genotipos JU1200 y JU751 se indican en rojo y azul, respectivamente, y se indican para cada uno de los loci y el fondo debajo del gráfico. Las barras cruzadas y las barras de error representan medias marginales estimadas ± errores estándar de un modelo lineal generalizado (bilateral). Las letras minúsculas indican contrastes por pares significativos (p < 0,05) ajustados por Tukey, de modo que los grupos que comparten una letra no son significativamente diferentes. Los valores n en seis bloques para cada genotipo se indican en las barras. c–e Las mismas medias derivadas del modelo ± errores estándar que en el panel b presentado para mostrar las interacciones entre los loci y el fondo. Los gráficos con ejes negros muestran solo interacciones bidireccionales. La tercera dimensión se representa como una división en dos gráficos con ejes rojo y azul que indican los genotipos para el locus dado en la parte inferior izquierda. Los valores p de interacción bidireccional se dan en los gráficos. Los análisis se llevaron a cabo en datos sin procesar (área PZ en píxeles), pero los ejes y se escalaron a μm2 para la presentación (0,0504 μm2/píxel) (consulte la Nota complementaria 11 para obtener detalles del modelo). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para interpretar el modelo, es útil comparar las medias marginales estimadas (Fig. 6b, Nota complementaria 11b). El examen de las interacciones genéticas de los dos loci y los antecedentes genéticos revela una epistasis generalizada y fuerte que explica la variación en el tamaño de la PZ. Como se mencionó anteriormente (Fig. 5b), la eliminación lag-2 (cgb1007) tiene efectos fenotípicos opuestos según el fondo genético: la eliminación reduce fuertemente el tamaño de PZ en JU1200 pero aumenta el tamaño de PZ en JU751 (Fig. 6b). El examen de las interacciones epistáticas muestra que los efectos de la variante lag-2 (cgb1007) dependen en gran medida tanto de C2 como de los antecedentes genéticos, por lo que la eliminación de lag-2 puede tener consecuencias negativas, positivas o no fenotípicas en todo el conjunto de genotipos (Fig. 6b–e). De manera similar, los efectos fenotípicos de C2 dependen en gran medida del contexto genético: C2-JU751 reduce el tamaño de PZ en todos los genotipos (Fig. 6b: i frente a ii, v frente a vii y vi frente a viii) excepto JU1200C5-lag- 2p(-) (Fig. 6b—iii frente a iv). La presencia de la deleción lag-2 amortigua el efecto de C2-JU751 en el fondo JU1200 (Fig. 6e' y e"), lo que podría implicar que los alelos dentro de C2 actúan, al menos en parte, a través de esta región del lag- 2. Como era de esperar, el efecto combinado de todas las demás variantes no identificadas en el fondo genético tiene la mayor influencia en el tamaño general de la PZ. Sin embargo, este efecto varía notablemente dependiendo de la presencia de la deleción lag-2p y los genotipos en C2. En general, el fondo JU751 reduce fuertemente el tamaño de la PZ (Fig. 6c' y c"), pero no hay una diferencia significativa entre JU1200C2-JU1200 y JU751C2-JU1200 cuando está presente la deleción lag-2 (Fig. 6b—iv vs. v, Fig. 6c'). Interpretamos que esto significa que, en presencia de la deleción lag-2 (lag-2p(-)), las variantes C2-JU1200 ejercen un fuerte efecto positivo para mantener el tamaño de PZ a pesar del efecto negativo promedio de las variantes en el fondo JU751 (Fig. . 6d", línea roja). Por el contrario, las variantes C2-JU751 no pueden mantener este efecto positivo, lo que da como resultado una sensibilidad de fondo (Fig. 6d", línea azul). Finalmente, sin la deleción lag-2p (lag-2p(+)), las variantes C2-JU751 no modifican el fuerte efecto negativo del fondo JU751 (Fig. 6d' vs. Fig. 6d" líneas rojas).

Nuestro modelo muestra que las interacciones epistáticas de orden superior contribuyen a la variación en el tamaño de la PZ de C. elegans. Es importante destacar que algunos de los efectos fenotípicos observados están enmascarados cuando solo se consideran interacciones bidireccionales (por ejemplo, Fig. 6e vs. e' y e"). Estos resultados resaltan la necesidad de precaución al interpretar el efecto fenotípico de una variante o alelo, ya que el efecto puede depender en gran medida de otras variantes en el fondo genético. También enfatizamos que incluso nuestras interpretaciones de los efectos de C2 y el fondo genético deben considerarse con cuidado, ya que son efectos agregados, que pueden estar influenciados por factores subyacentes. interacciones epistáticas y, posiblemente, efectos aditivos de loci estrechamente vinculados.

Nuestro estudio explora la variación natural y la arquitectura genética cuantitativa de un sistema de células madre germinales. Al examinar solo un puñado de aislados silvestres de C. elegans, pudimos detectar diferencias significativas en el tamaño de la zona progenitora (PZ) de la línea germinal, indicativo de la variación en la actividad del nicho de células madre germinales. Nuestros principales hallazgos son: (1) La variación natural en PZ entre dos aislamientos se asigna a múltiples QTL que interactúan parcialmente. (2) Un QTL en el cromosoma V contiene una deleción, exclusiva de JU751, en la región promotora del ligando lag-2 de DSL, una señal clave conocida que promueve el destino de las células madre germinales a través de la vía Notch. (3) La variación cuantitativa natural en la actividad proliferativa de la línea germinal de C. elegans surge a través de la modulación de la actividad transcripcional de los elementos centrales de señalización del nicho de células madre germinales. (4) La introgresión y las líneas de reemplazo alélicas revelan que los principales efectos e interacciones de los dos QTL en los cromosomas II y V (deleción lag-2) son en parte antagónicos y dependen en gran medida de los antecedentes genéticos. (5) Por lo tanto, las interacciones epistáticas de orden superior dan forma a la variación natural en la actividad del nicho de células madre germinales.

Nuestras observaciones sugieren que la actividad de nicho de células madre germinales de C. elegans es un rasgo complejo típico que involucra una arquitectura poligénica. Observaciones adicionales apoyan este punto de vista indirectamente: (1) el tamaño de la ZP varía continuamente, ya menudo sutilmente, en las poblaciones naturales (este estudio); (2) la deleción lag-2 no se encontró en otros aislamientos silvestres con tamaño de PZ pequeño (este estudio); y (3) las mutaciones en un gran número de genes modulan el tamaño de la PZ y estos genes exhiben diversas funciones que no solo actúan en la proliferación de células madre germinales, la progresión del ciclo celular y la diferenciación, sino también en diversos procesos metabólicos o sensoriales (revisado en25,39 ). Junto con nuestros hallazgos, estas observaciones sugieren que el tamaño de PZ de C. elegans es un fenotipo de orden superior que probablemente integra los efectos de la variación alélica en muchos loci. En el caso de nuestro ejemplo, al centrarnos en dos aislamientos diana con diferencias pronunciadas en el tamaño de la PZ, también identificamos loci o variantes de gran efecto en los cromosomas II y V cuyos efectos eran en parte antagónicos y, en general, fuertemente dependientes del contexto genético. Juntos, y en línea con estudios previos, esto sugiere que los efectos de las variantes de efectos grandes, incluso si se resuelven a nivel molecular (como la deleción lag-2 (cgb1007)), pueden ser engañosos si las interacciones epistáticas en el fondo nativo son ignorados4,79. Nuestro trabajo muestra que generar reemplazos alélicos en antecedentes NIL es un medio eficaz para descubrir estas interacciones, incluso cuando se desconocen las variantes específicas.

Al realizar el mapeo de QTL de enlace en un panel de RIL F2, derivados de dos aislados parentales con tamaño de PZ divergente, detectamos cuatro QTL que interactúan parcialmente. En el mejor modelo identificado por nuestro enfoque de selección de modelo multi-QTL, el QTL QII y QV actúan de manera aditiva para explicar el 32% de la variación fenotípica en la población RIL examinada. Sin embargo, el análisis de introgresión y líneas de reemplazo alélicas descubrió interacciones epistáticas extensas entre estos loci y el trasfondo genético. Este hallazgo no es sorprendente dado que las interacciones gen-gen contribuyen al componente de la varianza genética aditiva (VA) medida a nivel de población; es decir, una varianza alta de AV no necesita reflejar una acción génica aditiva7,80,81,82,83,84,85,86,87. En particular, las medidas de AV debidas a loci individuales dependerán en gran medida de las frecuencias alélicas de todos los loci que son epistáticos entre sí. Por lo tanto, las medidas de VA (y otros componentes de la variación genética, incluida la variación epistática) brindan poca o ninguna información sobre las interacciones epistáticas subyacentes y, por lo tanto, la arquitectura de los rasgos genéticos, incluso cuando se han detectado QTL. Por lo tanto, es esencial caracterizar la naturaleza molecular de los QTL y su interacción en entornos genéticos controlados.

La resolución de la región QV QTL identificó una eliminación única de 148 pb en la región promotora lag-2 de JU751, lag-2 (cgb1007). Esta eliminación elimina uno de los seis sitios E-box necesarios para la unión de HLH-2, un regulador positivo de la proliferación de células germinales mediada por lag-2 y la expansión de la línea germinal30,73. Se demostró que la mutación de estos sitios E-box da como resultado una reducción de la expresión del transgén lag-2::GFP específicamente durante la etapa L3 (y, posteriormente, una reducción de la proliferación de células germinales)73. Por lo tanto, esperábamos que lag-2 (cgb1007) causara una expresión reducida de lag-2 debido a la actividad de unión reducida de HLH-2. De acuerdo con este escenario, la introducción de esta eliminación en JU1200 (con un gran tamaño de PZ) redujo significativamente tanto el tamaño de PZ como la expresión de lag-2 en el DTC (Fig. 5b, e). Por el contrario, restaurar la secuencia ancestral correspondiente (JU1200) de esta eliminación en JU751 (con un tamaño de PZ pequeño) redujo aún más, en lugar de aumentar, el tamaño de PZ junto con la expresión de lag-2 (Fig. 5b, f). El alelo de deleción lag-2 por sí solo, por lo tanto, ejerce efectos opuestos según el trasfondo genético (epístasis de signo). Sin embargo, el examen de la interacción entre la deleción lag-2 (cgb1007) (C5) y una porción central del cromosoma II QTL (C2) muestra que C2-JU1200 puede amortiguar esta reversión (Fig. 6c' vs. c"). Además, la eliminación de lag-2 modifica el efecto de C2 al amortiguar los efectos negativos de C2-JU751 en ambos fondos (Fig. 6e 'vs. e"). Esto indica que C2 interactúa con la región promotora lag-2, específicamente en la región de la deleción lag-2(cgb1007). No tenemos hipótesis sobre la naturaleza molecular de esta interacción ya que ninguno de los genes (hlh-2, lin-39, unc-130, daf-3/daf-5, ces-1) tiene sitios de unión confirmados o elementos de respuesta. en la región del promotor lag-2 están ubicados dentro de la región C2. Además, aunque existen polimorfismos codificadores (JU1200 versus JU751) en algunos de estos genes (lin-39, unc-130 y daf-5), ninguno ocurre en hlh-2, daf-3 y ces-170. Por lo tanto, sería necesario resolver el QTL QII para diseccionar esta interacción genética. En general, la deleción de lag-2 que contiene un sitio de unión a HLH-2 que previamente se demostró que afecta positivamente la expresión de lag-2 en N2, puede tener efectos positivos, negativos o neutrales según el contexto genético (Fig. 6).

Aunque no está claro si la deleción de lag-2 (cgb1007) contribuye a reducir el tamaño de la PZ en JU751 y cómo lo hace, nuestras mediciones de smFISH de las transcripciones de lag-2 en el DTC brindan un respaldo inequívoco de que las diferencias en la actividad transcripcional de lag-2 contribuyen a las diferencias en el germen. Actividad de nicho de células madre observada entre JU751 y JU1200. Las mediciones de lag-2 smFISH reflejaron de cerca las mediciones del tamaño de PZ no solo en los aislamientos parentales sino también en los ARL recíprocos, en los que se manipuló el fragmento del promotor lag-2 (Fig. 5b). La identificación y caracterización de esta variante muestra que la variación natural en el tamaño de la PZ puede ocurrir a través de la modificación directa de las señales centrales que actúan en el nicho de células madre de C. elegans. Sin embargo, no podemos descartar contribuciones adicionales de otras variantes no identificadas en el QV QTL. Del mismo modo, aunque no observamos ningún efecto obvio en otros procesos de desarrollo larvario relacionados con la señalización de Notch (incluida la regulación mediada por HLH-2) en cepas portadoras de lag-2 (cgb1007), como la especificación del destino celular AC/VU30,73, no los analizó específicamente y, por tanto, no puede descartarlos.

Si bien la actividad de cualquier sistema de células madre germinales es obviamente relevante para la aptitud reproductiva del organismo, no está claro si la variación natural observada en la proliferación de células germinales (y el tamaño de la PZ) podría traducirse en una variación en la aptitud reproductiva y cómo. Aunque se ha encontrado que una mayor proliferación de células germinales se correlaciona con una mayor actividad de puesta de huevos, producción de crías y calidad de los huevos10,25,31,32,58,88,89, no está claro hasta qué punto esta relación es causal: C. elegans se reproduce principalmente a través de hermafroditas autofertilizantes, que secuencialmente producen espermatozoides y luego ovocitos para el resto de la vida. En condiciones de laboratorio, esto hace que la fecundidad de C. elegans se vea limitada por la cantidad de esperma propio (~250) producido inicialmente. El tamaño de PZ generalmente se mide, como en nuestro estudio, durante la etapa adulta temprana, por lo que es probable que muchas de las células progenitoras observadas nunca se conviertan en ovocitos maduros y se fertilicen durante la autofecundación. Sin embargo, el aumento de la proliferación de células germinales permite mejorar la calidad de los ovocitos al aumentar el flujo y la cantidad de ovocitos que experimentan muerte celular fisiológica (apoptosis), por lo que se liberan recursos para la provisión de ovocitos sobrevivientes10,25,31,32,58,88,89. Por lo tanto, si bien el tamaño de la PZ adulta puede no ser un indicador directo del potencial reproductivo futuro (número de crías), puede mejorar la calidad de la descendencia a través de un mejor aprovisionamiento de ovocitos. Además, el tamaño de PZ adulto también refleja la actividad proliferativa pasada de etapas larvarias anteriores, como lo ilustran nuestras cuantificaciones de actividad proliferativa (Figs. 2b, 5d). La variación en el tamaño de la PZ adulta podría reflejar una inversión reproductiva diferencial durante el desarrollo de las larvas, lo que puede compensar la asignación de energía al desarrollo somático.

Con respecto a las diferencias de aptitud reproductiva de los aislamientos objetivo en nuestro estudio, JU751 y JU1200, hemos demostrado previamente que los hermafroditas JU751 autofecundados han reducido significativamente el tamaño de la cría en relación con JU120071. Esta reducción no se debe a la producción diferencial de espermatozoides, sino en parte a una variante de efecto mayor que causa la eclosión matricida temprana en JU75171. Aún así, incluso después de corregir esta variante genética en JU751, el tamaño de la cría sigue siendo significativamente menor en JU751 en relación con JU120071. Es posible que la proliferación reducida de células germinales (y PZ adulta más pequeña) en JU751 refleje una inversión reproductiva más baja. Por supuesto, este escenario es altamente especulativo y las diferencias observadas no necesitan ser adaptativas. De manera similar, ignoramos si alguno de los QTL detectados, incluida la eliminación de lag-2 (cgb1007), se mantiene mediante selección. Incluso si es selectivamente ventajoso, no está claro si los QTL se seleccionaron debido a sus efectos sobre la actividad proliferativa de la línea germinal o debido a los posibles efectos pleiotrópicos en procesos adicionales fuera de la línea germinal, que se sabe que involucran la señalización de Notch durante el desarrollo larvario30,73.

Aquí nos enfocamos en el análisis de dos QTL de gran efecto y sus interacciones, detectadas usando un panel bastante pequeño de RIL (n = 70). Por lo tanto, la detección de interacciones epistáticas adicionales y de efecto pequeño a través del mapeo de enlaces no fue factible dada la potencia estadística relativamente baja. Sin embargo, una búsqueda específica de loci que interactúan con efectos opuestos produjo dos QTL candidatos en los cromosomas I y X (Fig. 3h). Es probable que el análisis adicional de esta interacción antagónica se vea limitado por su tamaño de efecto relativamente pequeño y las interacciones ya complejas entre el cromosoma II QTL, lag-2 (cgb1007) y los antecedentes genéticos. Además, se requieren más experimentos de mapeo fino para comprender completamente las interacciones epistáticas entre QII y QV QTL descubiertas aquí. Ambos QTL podrían albergar múltiples loci que afecten la variación del tamaño de la PZ, lo que podría incluir también loci antagónicamente estrechamente vinculados, que parecen ser comunes en C. elegans79.

Más allá de estas limitaciones técnicas, varios otros problemas complican la interpretación de nuestros hallazgos. En primer lugar, las poblaciones de mapeo artificial, como el panel F2 RIL utilizado aquí, pueden generar nuevas interacciones epistáticas a través de la interrupción de las regiones genómicas vinculadas. Esto es particularmente relevante para C. elegans, una especie predominantemente autofecundante, con una recombinación efectiva baja que conduce a un fuerte desequilibrio de ligamiento74,90,91,92. Lo más destacado es que los cruces entre aislamientos silvestres de Caenorhabditis autofecundante han descubierto una fuerte y consistente depresión cruzada debido a incompatibilidades genéticas generalizadas que reducen la supervivencia y la reproducción91,93,94,95,96. Tales interacciones epistáticas de nuevas combinaciones alélicas generadas en poblaciones artificiales de C. elegans son, por lo tanto, particularmente probables de afectar rasgos que involucran una arquitectura poligénica4,17,79,97,98. En otras palabras, las interacciones epistáticas observadas en paneles de mapeo artificial no necesariamente reflejan interacciones epistáticas que ocurren en la naturaleza. Sin embargo, su estudio proporciona información sobre la arquitectura genética que subyace a la variación de los rasgos.

Junto con investigaciones anteriores, nuestro estudio refuerza la opinión de que las generalizaciones sobre la arquitectura de rasgos basadas en el estudio aislado de variantes moleculares individuales en antecedentes genéticos únicos probablemente sean engañosas. La combinación de enfoques genéticos cuantitativos y del desarrollo es, por lo tanto, esencial para comprender la arquitectura de rasgos cuantitativos complejos frente a interacciones epistáticas y, a menudo, idiosincrásicas. Dado que actualmente (y probablemente durante mucho tiempo) incluso los experimentos más sofisticados pueden interrogar solo una pequeña fracción de todas las interacciones epistáticas posibles, la integración de enfoques genéticos cuantitativos y de desarrollo ofrece la mejor opción para acercarnos un paso más a la comprensión de la base genética de fenotipos y su variación.

Todas las cepas de C. elegans utilizadas en este estudio se enumeran en Datos complementarios 2. Se usaron métodos estándar de C. elegans para mantener todas las cepas a 20 °C en placas NGM de agar al 2,5 % sembradas con la cepa de E. coli OP5099,100,101. Todos los experimentos se realizaron en hermafroditas. Todas las cepas o materiales biológicos están disponibles de los correspondientes autores previa solicitud.

Las imágenes de las gónadas diseccionadas fijadas en metanol helado al 100 % y teñidas con DAPI (VECTASHIELD® Antifade Mounting Medium with DAPI) se tomaron con un microscopio Olympus BX61 con una cámara CoolSnap HQ2. Se realizaron pilas Z con incrementos de 1 μm en el canal DAPI con un aumento de 40x. Los núcleos se contaron a mano utilizando ImageJ2 v2.9.0/1.53t102. Primero, la ZP se definió como la región adyacente a la celda de la punta distal que termina en el límite de la zona de transición donde se pueden observar dos o más núcleos en forma de media luna por fila de células germinales38. La pila de imágenes se recortó en la zona progenitora hasta el límite de la zona de transición y se contaron los núcleos.

La proliferación de células germinales mitóticas se cuantificó en larvas L4 usando el kit Click-IT EdU de Thermofisher (Cat: C10338) de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario. Brevemente, los gusanos se sincronizaron a través del tratamiento con hipoclorito (lejía 1:1:2: NaOH 1 M: H2Od durante 6 min, luego se centrifugaron y se lavaron 3 veces en tampón M9) y se permitió que los huevos eclosionaran durante la noche en tampón M9 a 20 °C. Los huevos se sembraron a una densidad de ~400 huevos/placa y se dejaron desarrollar hasta L4. Se aislaron, lavaron y sumergieron en 100 μL de EdU 20 mM en tampón M9 durante exactamente 15 minutos (tiempo suficiente para teñir el 50-75 % de la PZ). en adultos jóvenes). Los gusanos se lavaron rápidamente en M9 para eliminar la EdU y las gónadas se liberaron cortando los portaobjetos de vidrio adheridos (Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides). Se utilizó una pequeña cantidad de levamisol para anestesiar a los gusanos. Las gónadas diseccionadas se lavaron cuidadosamente en los portaobjetos, se fijaron en PFA al 4% y se lavaron nuevamente. Los lavados se realizaron mediante la aplicación de pequeños volúmenes de solución directamente al tejido en los portaobjetos seguido de una cuidadosa aspiración. Después de un lavado final en dH2O, el tejido se secó en un calentador de portaobjetos (35 °C durante 5 min) para adherir el tejido a los portaobjetos. Los portaobjetos se empaparon en MeOH al 100 % a -20 °C durante la noche. Al día siguiente, los tejidos se rehidrataron en PBST y se realizó la tinción con EdU usando el kit Click-IT EdU de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El protocolo de tinción Click-IT se repitió una vez y luego los portaobjetos se montaron con VECTASHIELD® Antifade Mounting Medium con DAPI. Las imágenes se realizaron a través de un objetivo de 40x en un microscopio Olympus BX61 con una cámara CoolSnap HQ2. Se tomaron pilas Z a través de la gónada distal (una por gusano). Los núcleos de PZ positivos para EdU y teñidos con DAPI se contaron a mano utilizando ImageJ2 v2.9.0/1.53t102.

La cuantificación del número de células germinales de PZ puede ser un paso limitante en la puntuación del tamaño de PZ entre muchas muestras. Para superar este obstáculo, desarrollamos un método simple para estimar el tamaño de PZ y lo usamos como un proxy para el número de celdas de PZ (Fig. 1b y c). En resumen, las líneas se sincronizaron mediante tratamiento con hipoclorito (lejía 1:1:2:NaOH 1 M:H2O d. durante 6 min, luego se centrifugaron y se lavaron 3x en M9). Los huevos se dejaron eclosionar en tampón M9 a 20 °C durante la noche. Al día siguiente, los huevos se colocaron en placas a una densidad de ~400 gusanos/placa en medio NGM estándar sembrado con OP50. Se permitió que las larvas se convirtieran en adultos jóvenes a 20 °C. Los adultos jóvenes se recogieron lavando las placas cuando la mayoría de los animales mostraban de 1 a 10 huevos en el útero. Las muestras se lavaron en M9 y se fijaron en metanol helado durante al menos 5 min. Para preparar muestras para la obtención de imágenes, los gusanos se rehidrataron en M9 y se aplicaron a portaobjetos de vidrio con medio de montaje Vectashield que contenía DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las regiones de la línea germinal distal de hermafroditas adultos jóvenes (que contienen de 1 a 10 embriones en el útero) se tomaron imágenes a través de un objetivo de 40x en un microscopio Olympus BX61 con una cámara CoolSnap HQ2. Se tomaron imágenes de un brazo de gónada por gusano, siendo ese el brazo que estaba más cerca de la lente del objetivo. Se tomó una sola imagen para cada gusano, con el plano de la sección capturando la mayoría de los núcleos en un lado de la gónada de modo que los núcleos en forma de media luna fueran visibles, y la forma de la gónada en ese plano era representativa de la mayoría de los planos (Fig. .1b). Luego se cuantificó el tamaño de PZ para cada imagen. La zona progenitora se definió como la región adyacente a la célula de la punta distal que termina en el límite de la zona de transición donde se pueden observar dos o más núcleos en forma de media luna por fila de células germinales38. La PZ se recortó de todos los demás tejidos usando ImageJ2 v2.9.0/1.53t102, y la herramienta de umbral se usó para maximizar la cantidad de núcleos de PZ resaltados y minimizar cualquier fondo resaltado. El número de píxeles resaltados se registró como Área PZ. Este método de estimación se correlaciona bien con los recuentos manuales de núcleos PZ (Fig. 1c).

Cuantificamos el tamaño de PZ en un conjunto de 70 RIL con genotipo SNP derivados de los dos padres, JU1200 y JU75171,103. Las líneas se dividieron en seis bloques de puntuación y se puntuaron en el transcurso de ocho semanas. Si bien algunas cepas se midieron en dos bloques separados, no todas lo fueron. La mayoría de las cepas se midieron solo una vez, con 30 a 40 individuos por cepa. Los promedios y las varianzas de las cepas que se midieron dos veces fueron similares entre las mediciones. Solo se utilizó un conjunto de medidas para el mapeo de QTL. El tamaño de la PZ se normalizó entre bloques utilizando un factor de corrección. El factor de corrección se derivó de las medias de mínimos cuadrados de cada bloque (paquete lsmeans v. 2.30-0) para cada observación (factor de corrección = LSMBlockX/LSMBlock1). El tamaño normalizado de la ZP se cartografió utilizando el paquete de software R/qtl (v. 1.50)72. En primer lugar, se derivó un mapa de ligamiento genético a partir de los genotipos SNP de los 70 RIL. Luego, se usó el mapeo de intervalos estándar QTL único y dos QTL basado en modelos ocultos de Markov para identificar el QTL candidato. Los umbrales de LOD se establecieron en el percentil 95 de las puntuaciones LOD máximas de todo el genoma derivadas de 5000 permutaciones aleatorias de los datos bajo la hipótesis nula global de cero QTL. Estos QTL candidatos sirvieron como punto de partida para el modelado de múltiples QTL en el que el software R/qtl genera puntajes LOD penalizados para cada modelo probado. Los modelos que funcionan mejor que la hipótesis nula de cero QTL tienen un LOD penalizado > 0. Seleccionamos el modelo con el puntaje LOD penalizado más alto según lo recomendado por los autores de R/qtl (Fig. 3j)72.

Para validar el intervalo genómico del QTL en el cromosoma II, construimos líneas casi isogénicas (NIL). Se retrocruzaron dos RIL con secuencia JU1200 en la región QTL (RIL128/NIC728 y RIL71/NIC671) y dos RIL con secuencia JU751 en la región QTL (RIL127/NIC727 y RIL54/NIC654) durante 10 a 12 generaciones para aislar la región en el antecedentes del padre opuesto. Las líneas se seleccionaron en cada generación en función del genotipado por PCR de varios INDELS en el QTL del cromosoma II (consulte los Datos complementarios 1 para los cebadores y los Datos complementarios 2 para las líneas creadas y sus genotipos).

Para validar el candidato INDEL aguas arriba de lag-2 en el QTL del cromosoma V, creamos líneas de reemplazo alélicas recíprocas (ARL) usando la edición CRISPR/Cas-9 usando un protocolo similar al descrito por104. Para introducir la deleción (cgb1007) en el fondo JU1200, seleccionamos una secuencia NIL que contenía JU751 a través de la mayor parte del cromosoma II QTL (NIC1701) e inyectamos sgRNA (Synthego Corp.) para inducir un corte doble alrededor del sitio de inserción en el retraso. 2 promotor (Fig. 2 complementaria, Datos complementarios 1). Coinyectamos un oligonucleótido donante monocatenario para actuar como plantilla de reparación (Datos complementarios 1). dpy-10 se utilizó en una estrategia co-CRISPR104. Las líneas de inyecciones separadas que contenían reemplazos exitosos en lag-2p se identificaron mediante genotipificación por PCR de la deleción y secuenciación de Sanger. Luego, estas líneas se cruzaron con JU1200 para segregar el cromosoma II que contenía la secuencia JU751 para generar líneas que contenían tanto la versión JU751 del QTL del cromosoma II como la deleción lag-2p(cgb1007) (NIC1713, NIC1714, NIC1715), así como una línea que contiene solo la eliminación lag-2p (cgb1007) en el fondo JU1200 (NIC1720). Para reemplazar la secuencia de eliminación ancestral lag-2p (cgb1008) en el fondo JU751, seleccionamos una secuencia NIL que contiene JU1200 en el cromosoma II QTL (NIC1672) e inyectamos ARN guía (Synthego Corp.) (Datos complementarios 1) para inducir una doble corte alrededor del sitio de inserción. Coinyectamos un producto de PCR de doble cadena que contiene la secuencia ancestral (JU1200) con lag-2p (cgb1008) para actuar como plantilla de reparación (Datos complementarios 1). dpy-10 se utilizó en una estrategia co-CRISPR según 104. Las líneas de inyecciones separadas que contenían reemplazos exitosos se identificaron mediante genotipificación por PCR de lag-2p (cgb1008) y secuenciación de Sanger. Luego, estas líneas se cruzaron con JU751 para segregar el cromosoma II que contenía la secuencia JU1200, dejándonos con líneas que contenían tanto la versión JU1200 del QTL del cromosoma II como lag-2p(cgb1008) (NIC1716, NIC1717, NIC1719), así como líneas que contenían solo lag-2p (cgb1007) en el fondo JU751 (NIC1723, NIC1724, NIC1725). Para obtener una tabla de todas las líneas creadas y genotipos, consulte Datos complementarios 2.

Los gusanos se sincronizaron con lejía como se indicó anteriormente y se cultivaron a 20 ° C hasta la etapa de desarrollo adecuada. A continuación, los gusanos se retiraron de las placas y se fijaron en 1 ml de fijador nuevo (formaldehído al 4 % en PBS) durante 40 min. Los gusanos se lavaron dos veces en PBS, se resuspendieron en 1 ml de etanol al 70 % y se almacenaron a 4 °C durante varios días. Un conjunto de sondas de ARN lag-2 (Barkoulas et al. 2013) acoplado a AF594 (Custom Stellaris Fish Probes, Biosearch Tech, Teddington UK) se resuspendió en tampón TE libre de ARNasa (pH 8) para hacer un stock de 100 μM y luego se diluyó 1 :30 (solución de trabajo) en agua libre de ARNasa. Los gusanos fijados se lavaron durante 3 min en 1 ml de solución de lavado (formamida desionizada al 10 % y tampón de citrato de sodio salino 2x (Ambion) en agua libre de ARNasa). Luego, los gusanos se resuspendieron en 100 μL de solución de hibridación (formamida al 10 %, sulfato de dextrano al 10 %, 2x SSC) + 1 μL de la solución de trabajo de la sonda lag-2 y se incubaron en la oscuridad a 30 °C durante la noche. Al día siguiente, las muestras se enjuagaron, se lavaron 30 min a 30 °C en solución de lavado y se tiñeron 30 min a 30 °C en 1 mL de solución de lavado + DAPI (7,5 μg/mL final, Sigma). Finalmente, las muestras se lavaron dos veces en PBS y se montaron en portaobjetos de vidrio en medio de montaje antidecoloración de diamante Prolong (Eugene, OR). Se tomaron imágenes de los gusanos bajo epifluorescencia en un microscopio Zeiss Z.1 invertido con un objetivo de inmersión en aceite de 100x. Se utilizaron los mismos ajustes de iluminación y exposición (software Zen 3.2 Blue Edition) para todas las muestras. Las pilas Z se tomaron a través del DTC con un tamaño de paso de 0,4 μm y los puntos fluorescentes se cuantificaron a mano utilizando el software ImageJ2 (NIH, Bethesda, MD, http://rsb.info.nih.gov/ij/)102.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando R Statistical Software (R versión 4.2.0, RStudio 2022.02.3 compilación 492) utilizando modelos mixtos lineales generalizados105. Los datos se ajustaron a modelos gaussianos o binomiales negativos (nbinom2) utilizando el paquete glmmTMB v. 1.1.3106. Los diagnósticos residuales se realizaron utilizando el paquete DHARMa v. 0.4.5 de acuerdo con las pautas del desarrollador107. Cuando se justificó la selección del modelo, se utilizó el criterio de información bayesiano (BIC) para seleccionar el modelo óptimo. Se utilizó el paquete emmeans v. 1.7.4-1 para calcular las medias marginales estimadas del modelo, los errores estándar y los valores p corregidos por Tukey para contrastes por pares108. Para el ajuste del modelo del conjunto de datos de interacción correspondiente a la Fig. 6, se calculó D2 usando el paquete modEvA v. 3.078. Los detalles específicos de cada análisis de datos se describen en las leyendas de las Notas complementarias, que muestran los resultados estadísticos (Notas complementarias 1 a 12). Otros paquetes de R utilizados para la manipulación y el trazado de datos incluyen tidyverse v. 1.3.1109, MASS v. 7.3-57110, ggbeeswarm v. 0.6.0111, rnaturalearth y rnaturalearthdata v. 0.1.0112, rgeos v. 0.5-9113 y sf v .1.0-7114.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos sin procesar se proporcionan en el archivo de datos de origen. Las siguientes bases de datos disponibles públicamente fueron referenciadas y utilizadas en este estudio: Wormbase WS283 (https://wormbase.org/#012-34-5) y C. elegans Natural Diversity Resource (https://elegansvariation.org/). Este artículo no reporta ningún algoritmo original. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Solo se generó un código limitado para usar los paquetes R para el análisis estadístico y para generar gráficos personalizados de acuerdo con las pautas de los desarrolladores (consulte las Notas complementarias 1-12 y los Métodos).

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Agradecemos a Nausicaa Poullet, Anne Vielle y Clotilde Gimond por sus contribuciones al trabajo experimental que inició este proyecto. Agradecemos a Fabien Duveau, Marie-Anne Félix, Luke Noble, Alistair McGregor, Clotilde Gimond, Laure Mignerot y Joao Picao Osorio por la discusión, los útiles comentarios sobre versiones anteriores del manuscrito y el asesoramiento técnico. Las cepas de C. elegans fueron proporcionadas amablemente por Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) y Marie-Anne Félix. También nos gustaría agradecer a CeNDR (https://elegansvariation.org/) y WormBase (https://wormbase.org/) por proporcionar recursos sin los cuales los análisis realizados aquí no habrían sido posibles. Este estudio fue apoyado por subvenciones para proyectos de la Fondation ARC sur la recherche sur le cancer (PJA 20161205047 a CB) y la Agence Nationale de la Recherche (ANR-17-CE02-0017 a CB) SRF fue apoyado por una beca postdoctoral de la ciudad de Niza, Francia (Ville de Nice: Aides Individuelles Jeunes Chercheurs). Reconocemos el apoyo institucional adicional del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), el Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm) y la Université Côte d'Azur (UCA).

Estos autores contribuyeron igualmente: Asma Sandjak, Bénédicte Billard.

Universidad Costa Azul, CNRS, Inserm, IBV, Niza, Francia

Sarah R. Fausett, Asma Sandjak, Bénédicte Billard & Christian Braendle

Departamento de Biología y Biología Marina, Universidad de Carolina del Norte Wilmington, Wilmington, NC, EE. UU.

Sarah R. Faucett

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Conceptualización, SRF y CB; Metodología, SRF, AS, CB; Investigación, SRF, BB y AS; Análisis Formal y Visualización, SRF; Redacción—Borrador original, SRF; Redacción: revisión y edición, SRF, CB; Supervisión y Administración de Proyectos, CB; Adquisición de Financiamiento, CB, SRF

Correspondencia a Sarah R. Fausett o Christian Braendle.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Eric Haag, Ekaterina Voronina y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Fausett, SR, Sandjak, A., Billard, B. et al. La epistasis de orden superior da forma a la variación natural en la actividad del nicho de células madre germinales. Nat Comun 14, 2824 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38527-0

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Recibido: 12 diciembre 2022

Aceptado: 05 mayo 2023

Publicado: 17 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38527-0

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