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Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4753 (2022) Citar este artículo

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La espectroscopia de infrarrojo medio es una técnica sensible y selectiva para sondear moléculas en fase gaseosa o líquida. La investigación de reacciones químicas en aplicaciones biomédicas, como la producción de fármacos, está cobrando especial interés recientemente. Sin embargo, el monitoreo de procesos dinámicos en líquidos generalmente se limita a sistemas voluminosos y, por lo tanto, requiere análisis fuera de línea que consumen mucho tiempo. En este trabajo, mostramos un sensor a escala de chip robusto, completamente integrado y de próxima generación para mediciones en línea de la dinámica de moléculas en una solución líquida. Nuestro dispositivo del tamaño de la punta de un dedo utiliza tecnología de cascada cuántica, que combina el emisor, la sección de detección y el detector en un solo chip. Esto permite mediciones en tiempo real que sondean solo cantidades de microlitros de analito en una configuración in situ. Demostramos el funcionamiento del dispositivo con resolución temporal mediante el análisis de los cambios conformacionales inducidos por la temperatura de la proteína modelo albúmina sérica bovina en agua pesada. Las mediciones cuantitativas revelan excelentes características de rendimiento en términos de linealidad del sensor, amplia cobertura de concentraciones, desde 0,075 mg ml−1 hasta 92 mg ml−1 y una absorbancia 55 veces mayor que los sistemas de referencia voluminosos y fuera de línea de última generación. .

Los sensores han entrado en nuestra vida diaria en innumerables niveles, desde diagnósticos médicos1,2,3, detección ambiental e investigación climática4,5 hasta imágenes espectrales6 y aplicaciones de seguridad7. Detectan, analizan y reaccionan a todo tipo de sustancias relevantes, por ejemplo, productos químicos potencialmente peligrosos8. Si bien la espectroscopia en fase gaseosa del infrarrojo medio (IR medio) se aprovecha bien en la actualidad para aplicaciones de detección basadas en la tecnología de cascada cuántica (QC)9,10,11, las técnicas de detección de líquidos aún están en pañales12,13,14. Incluyen, por ejemplo, tratar de abordar las bandas de absorción muy amplias (>10–50 cm−1) en el medio de densidad mucho más alta de los líquidos15,16,17. Esto se convierte en una tarea aún más desafiante cuando se detectan analitos objetivo en (i) niveles de concentración muy bajos (ppb a ppt) o (ii) concentraciones que cambian rápidamente, mientras se investigan reacciones químicas o cambios conformacionales de moléculas. Las características deseables para los sensores que monitorean procesos dinámicos en la fase líquida incluyen tiempos de respuesta rápidos, alta sensibilidad y especificidad, así como la capacidad de analizar amplios rangos de concentración dinámica en tamaños de muestra de microlitros.

En consecuencia, es muy beneficioso para un sensor de alta especificidad apuntar a la región de huellas dactilares espectrales de las absorciones de moléculas fundamentales en el rango espectral del infrarrojo medio (~500–1700 cm−1 18,19), y en particular a la región de la proteína amida Banda I (~1600–1700 cm−1) en el caso del análisis de proteínas20.

La sensibilidad de un sensor depende de su comportamiento ante el ruido y de la pendiente de la línea de calibración. En las técnicas espectroscópicas basadas en la ley de Beer-Lambert, la sensibilidad se puede adaptar maximizando la longitud de interacción efectiva de la luz dentro de la muestra. Sin embargo, los valores típicos de longitud de absorción en el IR medio en solución acuosa se encuentran en la escala micrométrica baja para las técnicas existentes y, a menudo, utilizan dispositivos voluminosos9,14,21. En consecuencia, las fuentes de luz de alta potencia como los láseres de control de calidad (QCL) y los detectores de alto rendimiento, como los detectores de control de calidad (QCD), son herramientas favorables para las mejoras. Permiten abordar aplicaciones del mundo real en la espectroscopia de fase líquida de IR medio y son capaces de sondear espesores de película de muestra mucho más allá de unos pocos micrómetros, lo que permite un manejo de muestra simplificado y más sólido8,13,22.

En contraste con la especificidad y la sensibilidad del sensor que ya se abordaron en los primeros experimentos en la literatura23, queremos demostrar un concepto que muestra un progreso significativo en dos características críticas adicionales:

(i) Los procesos dinámicos, como los que se encuentran en las reacciones químicas24 o los cambios conformacionales, es decir, los cambios estructurales de la estructura tridimensional de una molécula13, revelan características importantes que deben analizarse con alta resolución temporal para su adecuada investigación. Un sensor in situ para mediciones en tiempo real sin etiquetas es la herramienta ideal para monitorear esos cambios de analitos, evitando por completo los análisis fuera de línea que consumen mucho tiempo.

(ii) La capacidad de analizar cantidades diminutas de líquidos en el chip permite esquemas de detección para aplicaciones del mundo real a través de la miniaturización del sensor. Esto incluye mediciones en línea de muestras de microlitros, que solo interfieren mínimamente con los procesos químicos.

En este trabajo, presentamos un sensor de IR medio integrado completamente monolítico, que combina todas las características anteriores en un solo dispositivo miniaturizado. A través de la combinación del láser, la región de interacción y el detector en un chip, y evitando las limitaciones de difracción típicas de los sistemas fotónicos a escala de chip convencionales6,25 mediante la explotación de guías de ondas plasmónicas26,27,28, logramos un tamaño de punta de dedo (<5 × 5 mm2 ) sensor de líquido rápido de última generación. Los resultados de la simulación confirman la conservación de las capacidades plasmónicas en un entorno líquido y permiten el uso de QCLD espectralmente optimizados, es decir, dispositivos que emiten y detectan fotones de longitud de onda similar29. Realizamos dos tipos de mediciones en nuestro estudio. Determinamos la línea de calibración del sensor y realizamos experimentos de desnaturalización térmica, monitoreando el cambio relacionado de la estructura secundaria de la proteína, tanto de albúmina de suero bovino (BSA)12,13,30,31,32,33 en una matriz de D2O. Dado que nuestro trabajo incluye un análisis del rendimiento del sensor utilizando simulaciones ópticas de elementos finitos (FEM) con el software comercial COMSOL, también podemos confirmar teóricamente su excelente idoneidad para el funcionamiento in situ en una matriz líquida. Luego, determinamos cifras de mérito analíticas experimentalmente importantes, que incluyen: (1) LOD, (2) sensor-linealidad con la concentración del analito, (3) el rango de concentración accesible y el volumen de muestra de nuestro sensor, y (4) robustez frente a la luz directa. exposición al analito. Completamos nuestro estudio demostrando el funcionamiento de nuestro sensor QCLD cuando se sumerge en agua normal (H2O), como matriz biofísicamente nativa y más relevante. Como consecuencia directa de la intensidad totalmente absorbida del modo óptico en el agua, debido a la gran profundidad de penetración efectiva del sensor, podemos usar simultáneamente la señal del detector medida restante de este experimento para la corrección de la diafonía eléctrica.

Nuestro objetivo es caracterizar con precisión nuestro sensor QCLD y extraer sus figuras de mérito relevantes, además de demostrar su capacidad para monitorear cambios en la estructura secundaria de proteínas en tiempo real. Para estos experimentos, usamos BSA como una proteína monomérica soluble en agua (ver Fig. 1a y Suplemento A). La BSA se usa con frecuencia en estudios biofísicos fundamentales, como la investigación de la desnaturalización térmica30,34,35 que conduce a cambios en la absorción del IR medio en la región amida I de las proteínas. Las investigaciones de la desnaturalización térmica de BSA se realizaron previamente con regularidad tanto en H2O como en D2O30,31,32,34,35, lo que proporcionó un rico conjunto de datos, especialmente para aquellos experimentos en agua pesada.

a Medida de referencia del espectrómetro infrarrojo por transformada de Fourier de reflexión total atenuada (ATR-FTIR) del proceso de desnaturalización térmica de BSA, analizada en el rango de la banda de amida I\(^{\prime}\) entre 50 ∘C (azul) y 90 ∘C (rojo). Se indica la transición inducida por la temperatura de hélice α (1651 cm−1, azul) a lámina β (1615 cm−1, roja). b Concepto de sensor en chip que incluye el modo plasmónico indicado. El emisor (QCL, 10 μm de ancho) y el detector (QCD, 15 μm de ancho) están conectados a través de una guía de onda plasmónica basada en SiN cónica de 48 μm de largo. Todo el sensor se sumerge en la solución de muestra (D2O + BSA), que se muestra en la capa transparente azul del chip. La capa dorada (guía de onda plasmónica y contactos eléctricos) se indica en color dorado, la pasivación de SiN y la capa de carga dieléctrica se muestran en marrón y el sustrato InP se indica en gris oscuro.

El agua pesada se emplea a menudo para el análisis de proteínas para evitar la superposición de la banda de flexión de HOH del agua con la región de proteína amida I en la espectroscopia de IR medio. Esto crea una ventana espectral abierta en este rango con absorción reducida, lo que permite longitudes de interacción más grandes12,30,31,32,35,36,37,38,39,40,41,42. Generalmente, el agua pesada puede proporcionar algunas desviaciones de las condiciones biofísicas totalmente nativas. Se encontró que la exposición de las proteínas al D2O puede influir en la longitud y la fuerza de los enlaces de hidrógeno y puede causar cambios en la dinámica de las proteínas43, así como la desnaturalización de las proteínas44. Pero estas diferentes propiedades del D2O también se pueden aprovechar en el análisis de muestras biológicas específicas, por ejemplo, para ralentizar significativamente las interacciones proteína-disolvente en células vivas para experimentos in vitro45.

Para el experimento aquí informado sobre la desnaturalización térmica de BSA, se encontró que las transiciones estructurales de BSA eran similares en H2O y D2O, con la única diferencia de una temperatura de transición más baja en agua pesada32. Trabajar en D2O nos permite registrar datos con una alta relación señal-ruido y explotar todo el potencial de nuestro concepto de sensor en el monitoreo de reacciones dinámicas. También permite aprovechar mucho mejor el concepto de detección plasmónica, que permite la propagación del modo óptico en escalas de longitud de decenas a cientos de micrómetros. Nuestro sensor en chip presenta una longitud de interacción de muestra de ~48 μm, lo que facilita el análisis de BSA en D2O en un amplio rango de concentración, que cubre más de tres órdenes de magnitud, desde ~75 μg ml−1 hasta >92 mg ml− 1. Por el contrario, el uso de un tampón de H2O altamente absorbente normalmente limita las longitudes de la ruta a un máximo de 10 μm en el caso de experimentos basados en FTIR de baja intensidad46 y a ~25 μm47 cuando se realizan mediciones de transmisión basadas en QCL de alta intensidad, con la consecuencia de una límite de detección (LOD) significativamente reducido.

La tecnología de cascada cuántica alberga herramientas muy potentes y versátiles para la espectroscopia de fase líquida y gas de IR medio2,14,26,48,49,50. La capacidad de operar un QCL imparcial como un fotodetector de alto rendimiento51,52,53 permitió la realización de QCL y QCD monolíticos integrados, señalados como un dispositivo QCLD29. Presenta una superposición espectral excelente entre el láser y el detector29. En este trabajo, desbloqueamos todo el potencial del concepto QCLD para aplicaciones ópticas de laboratorio en chip, adecuadas para el análisis de proteínas en el rango espectral de la banda amida I\(^{\prime}\)13,14,32 ,35.

El QCLD utilizado en este trabajo se basa en un diseño de región activa (AR) ligada al continuo, optimizado para la misma longitud de onda de emisión y detección. Para apuntar a la banda espectral de amida I\(^{\prime}\), que aloja el rango de absorción de BSA en D2O32,35, está diseñado para operar alrededor de 6,5 μm de longitud de onda. En particular, el AR se construye a partir de pozos cuánticos/barreras In0.53Ga0.47As/In0.52Al0.48As en un total de 37 cascadas, que se cultivan en forma de red emparejada con el sustrato n-InP mediante epitaxia de haz molecular (MBE) y intercalado en una estructura de guía de ondas. Para seleccionar modos de emisión espectral individuales que se dirijan a rangos de longitud de onda estrechos dentro de las amplias características de absorción del analito de ~20–40 cm−1, se implementa una rejilla de retroalimentación distribuida (DFB)54,55,56 en el revestimiento superior de la estructura de guía de ondas QCL57 ,58 (detalles sobre AR26: y rejilla DFB: Suplemento B). Como muestran Ristanić et al.27, esto conduce a anchos de línea en la escala de ~MHz e inferiores56 y mejora el ruido y las fluctuaciones de emisión en los láseres pulsados59,60.

Utilizamos guías de ondas de cresta Fabry-Pérot (FP) estándar para láser (~2,5 mm de largo) y detector (~200 μm de largo), separadas por una guía de onda de polaritón de plasmón de superficie con carga dieléctrica (DLSPP) de ~48 μm de largo (200 nm- placa gruesa de SiN encima de una capa inferior de Au de 60 nm de espesor, ver Fig. 1b). Este último se estrecha desde 10 μm de ancho en el QCL hasta 15 μm en el QCD. Debido a la baja conductividad eléctrica del analito, podemos sumergir directamente nuestro sensor en el líquido sin recubrimientos protectores adicionales. Aumentamos aún más la sensibilidad del sensor QCLD al abordar las fuentes de ruido de dispositivos técnicos dominantes de fluctuaciones de temperatura61,62 y diafonía eléctrica conocidas por compactar geometrías en chip17,63. El primero se abordó mediante mediciones de temperatura en el chip y el segundo mediante contactos eléctricos con mayor separación y una corrección de diafonía posterior al experimento. Las características detalladas de emisión espectral y detección del QCLD se muestran en la Fig. 1 complementaria.

El rendimiento espectral de una guía de ondas plasmónica está dominado por sus características estructurales y materiales (índice de refracción complejo n) en la longitud de onda objetivo λ, incluido el medio huésped circundante. Se demostró que para las guías de ondas DLSPP delgadas, una porción notable de >96 % del modo se guía fuera de la guía de ondas (espesor DLSPP ≪ longitud de onda), penetrando en el medio dieléctrico circundante, como, por ejemplo, el aire26. Esto hace que estas guías de ondas sean muy adecuadas para la espectroscopia de líquidos, ya que sus propiedades de propagación son susceptibles al medio que las rodea.

Para analizar nuestra guía de ondas DLSPP basada en SiN cuando se expone a D2O y BSA en D2O, simulamos la propagación del modo plasmónico utilizando el solucionador de modo propio del software comercial COMSOL basado en FEM (v.5.5). Nos centramos en las dos longitudes de onda de interés: 6,26 μm (1597 cm−1, serie de concentración) y 6,17 μm (1620 cm−1, experimento de desnaturalización de BSA). La figura 2a muestra el perfil de modo transversal en el aire a 6,17 μm con nSiN = 1,79.

a La sección transversal modal de la guía de ondas DLSPP de SiN en Au (nSiN = 1,79, dimensiones en el recuadro: dAu: espesor de oro, dSiN: espesor de SiN y wSiN: ancho de losa de SiN), b Simulación de vista superior 2D a lo largo de la guía de ondas DLSPP cónica de 48 μm entre QCL y QCD en aire (izquierda) y D2O (derecha), así como el perfil de la sección transversal longitudinal a lo largo de la guía de ondas DLSPP de 48 μm conducida en: c aire y d D2O. La línea blanca en a, c y d representa la capa plasmónica de Au.

El índice de refracción nSiN se obtiene a partir de las mediciones del elipsómetro de IR medio que se muestran en la Fig. 2 complementaria, lo que indica resultados similares a los de la literatura64. Los valores obtenidos en ambas longitudes de onda, es decir, 1597 cm−1 y 1620 cm−1, para la longitud de propagación Lp (1/distancia de decaimiento electrónico en μm), índice de modo efectivo neff y pérdidas (en dB mm−1 y dB por 48 μm = sección plasmónica entre QCL y QCD) se muestran en la Tabla 1. La longitud de propagación es un 7 % menor a longitudes de onda más cortas, como consecuencia de la geometría de la guía de onda plasmónica ligeramente más adecuada para longitudes de onda más largas28. Aún así, Lp es ≥1,7 mm, lo que corresponde a pérdidas por debajo de 0,13 dB para una sección de guía de onda de 48 μm, lo que confirma las características de baja pérdida de nuestras guías de onda DLSPP en el aire. El perfil de modo y neff muestran solo diferencias insignificantes en las dos longitudes de onda.

A continuación, comparamos los perfiles de modo longitudinal de 6,17 μm en el aire con el caso del D2O como medio circundante. Como muestra la Fig. 2, el modo está muy bien confinado en el aire (ver Fig. 2b, c), y observamos un acoplamiento de guía de ondas láser similar en D2O (ver Fig. 2d, ref. 40). Este es un resultado notable, porque el índice de refracción del aire (naire ≈ 1) es significativamente más bajo que el del D2O de \({n}_{{{{{{\rm{D}}}}}}}_ {2}{{{{{\rm{O}}}}}}}\) = 1,340. Aún así, el modo permanece muy bien confinado y guiado desde el láser hasta el detector, lo que demuestra la excelente idoneidad de la guía de ondas DLSPP para la espectroscopia de líquidos. La adición de BSA al D2O solo tiene un efecto insignificante en el índice de refracción (p. ej., Δn ~ 10−4 para 0,25–2 % m v−140) en comparación con el óxido de deuterio puro.

Finalmente, investigamos la influencia del D2O en el modo plasmónico mediante simulaciones 2D de vista superior de la guía de ondas DLSPP cónica, que muestra un corte horizontal a 60 nm por encima de la capa de SiN. Como se muestra en la Fig. 2b, solo hay diferencias menores cuando se compara el aire (izquierda) con el D2O (derecha), por lo tanto, también solo hay una reducción mínima del confinamiento de modo lateral.

Una forma común de medir la absorbancia de líquidos en el rango espectral IR medio se basa en la espectroscopia de reflexión total atenuada (ATR)65. En esta técnica, la muestra se coloca en la superficie de un elemento ATR ópticamente denso. La luz infrarroja que incide bajo un cierto ángulo se refleja en la interfaz hacia la muestra, penetrándola mínimamente con su campo evanescente.

En tal configuración, la absorbancia A de un líquido con el espesor de capa efectivo deff puede obtenerse usando la ley de Beer-Lambert9,66: A = deff ⋅ e ⋅ c, con el coeficiente de absorción molar decádico e y la concentración del analito C. Por lo tanto, una curva A vs c experimental muestra una dependencia lineal65,66 con la pendiente dada por el producto de deff ⋅ e.

La longitud de la trayectoria efectiva de nuestro sensor QCLD se determinó comparando su absorbancia con la de las mediciones del interferómetro infrarrojo de transformada de Fourier de reflexión total atenuada de reflexión única de referencia (ATR-FTIR). Para el accesorio ATR obtenemos: deff = 0,838 μm a 1597 cm−1, determinado en H2O (e = 10,9 L mol−1 cm−1)67.

Calibramos el rendimiento de nuestro sensor QCLD mediante una serie de concentraciones de BSA en D2O, obteniendo su curva A vs c. Lo comparamos con los resultados de otras técnicas de medición de vanguardia actuales, incluido el dicroísmo circular (CD) y la espectroscopia FTIR13, así como con sensores basados en ATR9, incluida, por ejemplo, la espectroscopia ATR-FTIR basada en fibra12. Además, extraemos valores de rendimiento importantes del sensor, como el LOD y la longitud de ruta efectiva dentro del deff del analito sondeado. Esto contrasta con estudios previos, principalmente realizando un análisis cualitativo34,35,40,68.

La figura 3 muestra la configuración de medición de la concentración. Incluye una solución madre de ~50 ml de BSA en D2O a una concentración fija de 150 mg ml−1. Utilizando una bomba peristáltica (Ismatec Reglo ICC, 3 canales, 8 rodillos) añadimos continuamente 1 ml de la solución madre a un segundo vaso de precipitados lleno con 30 ml de D2O puro (99,9 átomo % D). El sensor QCLD se sumerge directamente en el vaso de precipitados de D2O, lo que demuestra su solidez frente a la exposición directa a la solución que contiene proteínas. Para este experimento polarizamos el QCL 1 emitiendo a 1597 cm−1, medimos la señal de su correspondiente QCD 1 y la analizamos con un osciloscopio de 350 MHz (Teledyne LeCroy HDO4034 2.5 GSPS). Paralelamente, monitoreamos la temperatura del líquido con dos sondas de temperatura previamente caracterizadas: (i) polarizamos el QCL 2 vecino a 0.5 mA y monitoreamos su cambio de resistencia inducido por la temperatura usando un medidor de fuente (serie Keithley 2400), como un rápido encendido. sonda de temperatura del chip y (ii) además sumergimos una sonda de temperatura (Pt100) en el líquido.

Una bomba peristáltica bombea continuamente la solución madre (50 ml de BSA en D2O a 150 mg ml−1) al vaso de precipitados, inicialmente lleno de D2O puro. El sensor QCLD se sumerge directamente en este segundo vaso de precipitados para controlar los cambios de concentración.

La Figura 4 muestra las curvas A frente a c resultantes a 1597 cm−1 y temperatura ambiente medidas en unidades de absorbancia (AU) con nuestro sensor QCLD (cuadrados azules) y el sensor de referencia ATR-FTIR (círculos violetas). La absorbancia se obtiene normalizando la señal de BSA a su línea base de D2O medida previamente y tomando el logaritmo decádico de este valor. Como era de esperar para un sensor que sigue la ley de Beer-Lambert, obtenemos una línea de calibración lineal66. Queremos enfatizar nuestra capacidad para sondear 48 μm de solución para una amplia gama de concentraciones de BSA desde <100 μg ml−1 hasta >92 mg ml−1. Por el contrario, tales experimentos hasta ahora se realizaron típicamente con sistemas basados en ATR-FTIR grandes y voluminosos31,34.

Resultados en unidades de absorbancia (AU) del sensor QCLD para BSA en D2O con (estrellas rojas) y sin (cuadrados azules) corrección de diafonía de 18 mV (escala izquierda) y en comparación con el sistema ATR-FTIR de reflexión única (círculos violetas , escala derecha). La escala derecha se divide por un factor de 10 en comparación con la izquierda para una mejor visibilidad de la señal ATR-FTIR.

Los espectros ATR de la Fig. 1a revelan que la absorbancia A = 0,00118 AU (unidades de absorbancia) de BSA es bastante baja a 1597 cm−1 en una solución de BSA de 20 mg ml−1, lo que permite probar concentraciones más altas. Por el contrario, es preferible medir a alta absorbancia, para analizar el rango de baja concentración. Como se muestra en la Fig. 4 para 85 mg ml−1 y superiores, podemos observar desviaciones de la curva lineal. Son el resultado de una señal QCD baja para concentraciones crecientes de BSA. Podemos concluir que las concentraciones máximas que podemos medir con el sensor se esperan en el rango de 92 mg ml−1 a 1597 cm−1.

Una comparación directa con la medición ATR muestra que nuestro sensor en chip produce una absorbancia 39 veces mayor, superando claramente al sistema ATR-FTIR de última generación. Además, la capacidad de sumergir nuestro sensor directamente en el líquido sin medidas de protección adicionales es un claro beneficio de nuestro enfoque in situ y permite el monitoreo en línea en tiempo real de reacciones químicas en sistemas químicos avanzados. Esto contrasta fuertemente con las técnicas analíticas de vanguardia típicas, incluida la espectroscopia ATR-FTIR, que se limitan a mediciones fuera de línea o a mediciones en línea, cuando, por ejemplo, se fusiona una celda fluídica con el cristal ATR69 en un análisis aún más complejo. y sistemas voluminosos.

Si bien la compacidad del enfoque basado en QCLD conduce a las claras ventajas del sensor discutidas anteriormente, observamos la diafonía eléctrica como un inconveniente de la integración de tamaño pequeño (típicamente: <25 mm2). Este efecto parásito se puede cuantificar realizando mediciones en H2O desionizada (DI) de absorción total y corrigiendo las mediciones de BSA para la diafonía eléctrica obtenida. El resultado se representa en la Fig. 4 como estrellas rojas y produce valores de absorbancia incluso 55 veces mayores que la configuración ATR-FTIR. Esto se puede usar para estimar la profundidad de penetración efectiva deff,QCLD a través de: 55 × deff,ATR = 46.09 μm = deff,QCLD (con deff,ATR = 0.838 μm) y concuerda muy bien con la longitud real de 48 μm cuando se considera que El 96% del modo es guiado fuera de la guía de ondas.

Para un análisis cuantitativo adicional, también podemos calcular este valor utilizando los datos experimentales A-vs-c de la Fig. 4 en combinación con la fórmula ya presentada para la ley de Beer-Lambert y el deff,ATR = 0,838 μm obtenido anteriormente. El resultado se da en la Tabla 2. El valor obtenido de deff,QCLD = 43,1 μm está de nuevo en buen acuerdo con la longitud real de la guía de ondas plasmónica de 48 μm.

Como otra figura de mérito importante en la detección química, determinamos el LOD de nuestro sensor QCLD en comparación con la configuración ATR-FTIR como se indica en el Suplemento E. Para evaluar el LOD del sensor en el chip en un tiempo rápido escalas, calculamos la desviación estándar std(t) para múltiples intervalos de tiempo largos de ~11 s medidos para un BSA de 20 mg ml−1 en solución de D2O y determinamos el LOD correspondiente = 0,092 mV (consulte la Tabla 3, pendiente de la Fig. 3): esto corresponde al cambio de concentración mínimo detectable de BSA en mg ml−1 usando la línea de calibración medida en el rango de baja concentración 0–25 mg ml−1. Da como resultado una concentración de BSA mínima recuperable de: LOD (mg ml−1) = 75 μg ml−1 ⇒ LOD(ppm) = 75 ppm por peso y una cobertura de más de tres órdenes de concentraciones de (BSA), entre 75 μg ml−1 y 92 mg ml−1. Vale la pena señalar que nuestro sensor sumergido solo tiene temperatura estabilizada a través de la estabilidad de temperatura del líquido, mientras que la medición de temperatura en el chip solo se usó con fines de monitoreo, sin usarla para medidas de estabilización. A modo de comparación, la Tabla 3 muestra el LOD de la configuración ATR. Si bien la clara ventaja de la técnica ATR basada en FTIR radica en el registro de un espectro IR completo (400–4000 cm−1) dentro del tiempo de medición de 11 s, es un resultado notable que nuestro sensor en chip tenga un LOD 120 veces menor. El inconveniente de abordar una sola longitud de onda con nuestro sensor basado en QCLD se puede mitigar significativamente mediante la implementación directa de conceptos de matriz basados en QC17,70.

Otros enfoques para la detección de proteínas informados en la literatura, especialmente aquellos basados en SEIRAS (espectroscopía de absorción IR mejorada en superficie) combinados con técnicas ATR tradicionales, dan como resultado LOD incluso mejores que nuestro QCLD (factor de ~ 2.1 a ~ 18.1). Pero se basan en esquemas más complejos, por ejemplo, agregando diferentes tipos de nanopartículas de Au71,72. Esto contrasta con la superficie aún no funcionalizada de nuestro sensor QCLD, que es parte del trabajo futuro73,74.

En la Fig. 5 presentamos la configuración para el experimento de desnaturalización térmica de BSA. En este experimento, utilizamos una celda de flujo a escala de microlitros de 60 μl hecha a medida. La rutina de medición paso a paso se describe en la sección "Métodos".

Usamos una celda de 60 μl hecha a medida para este experimento. La solución madre (35 ml de BSA en D2O a 20, 40 y 60 mg ml−1) se calienta constantemente desde temperatura ambiente hasta 90 ∘C, mientras se bombea continuamente a través de un vaso de precipitados con líquido refrigerante a 20 ∘C y hacia la celda. que contiene el sensor QCLD. Después de la medición (continua), se bombea y se desecha.

Para monitorear el proceso de desnaturalización térmica31, empleamos un sensor QCLD que aborda una longitud de onda de 1620 cm−1. La Figura 6 muestra los resultados obtenidos. Los valores absolutos en unidades de absorbancia (AU) en la Fig. 6a incluyen la corrección de diafonía, como ya se discutió para la serie de concentración. Para obtener el valor de corrección de diafonía, usamos la relación de absorbancia esperada en las dos longitudes de onda: A(1620 cm−1) por A(1597 cm−1). Extraemos una diafonía de 6 mV, que concuerda muy bien con nuestro análisis del sensor a 1620 cm−1, lo que revela que podemos medir curvas de desnaturalización razonables a niveles de señal de aproximadamente 10 mV.

Investigación de tres concentraciones diferentes de BSA: 20 (rojo), 40 (azul) y 60 mg ml−1 (violeta) y extracción de la temperatura de transición x0. a Valores de medición absolutos (círculos) y curvas sigmoidales de Boltzmann-Fit (líneas continuas) en unidades de absorbancia (AU). b Comparación de las curvas de ajuste de Boltzmann (normalizadas individualmente), que muestra la dependencia de la temperatura y la concentración de las curvas de absorbancia de forma sigmoidal.

La Figura 6a muestra la señal de absorbancia para diferentes temperaturas entre 45 ∘C y ~90 ∘C para las tres concentraciones de 20 mg ml−1 (rojo), 40 mg ml−1 (azul) y 60 mg ml−1 (violeta) en 1620 cm−1. Podemos observar la forma sigmoidal esperada del proceso de desdoblamiento de la proteína13 para las tres concentraciones investigadas, lo que confirma hallazgos previos de la literatura34. Un beneficio adicional de nuestro experimento en línea se puede encontrar en su muy bajo consumo de líquido (tasa de bombeo: ~17 μl s−1, volumen de células microfluídicas: ~60 μl).

Para la evaluación cuantitativa de las mediciones y la comparación con la literatura, la Fig. 6b muestra la progresión de las curvas de absorbancia normalizadas para las tres concentraciones de BSA. Las líneas continuas muestran las curvas de la ecuación sigmoidal de Boltzmann correspondientes desde el ajuste a los datos de la Fig. 6a definidos como: y = A2 + (A1−A2) ⋅ (1 + \({e}^{{(x-x0)dx} ^{-1}}\))−1 con el valor de absorbancia inicial y final A1 y A2, respectivamente, la temperatura de transición x0 definida por el valor x0 que corresponde a y0 = (A1 + A2) ⋅ 2−1 y la pendiente dx. Siguen la misma forma de S que se observa en otros experimentos en la literatura con BSA31 y otras proteínas13, incluida la disminución de las temperaturas de transición x0 con el aumento de la concentración de BSA (ver también Schwaighofer et al. para, por ejemplo, la proteína poli-l-lisina13) .

Se demostró que tal comportamiento es una función de la tasa de calentamiento durante el proceso de desnaturalización. Por lo tanto, analizamos el calentamiento correspondiente para las tres concentraciones, confirmando tasas de calentamiento casi idénticas como se muestra en la Fig. 4 complementaria.

La matriz D2O proporciona condiciones muy similares para observar el proceso de desnaturalización de BSA inducido por la temperatura en comparación con las condiciones biofísicas completamente nativas en H2O. Por lo tanto, seleccionamos cuidadosamente este experimento, ya que las diferencias con H2O son solo un ligero aumento en la temperatura de transición para la desnaturalización de BSA32. Sin embargo, queremos demostrar la capacidad total de nuestro dispositivo monolítico para operar en una matriz de proteínas de la vida real y, por lo tanto, realizamos un experimento de inmersión adicional en H2O pura. Como se muestra en la Fig. 7, sumergimos todo el sensor en agua bajo polarización operativa con condiciones de conducción similares a las de D2O, durante aproximadamente un minuto, y monitoreamos la señal del detector. Como el H2O absorbe toda la intensidad del modo óptico, la señal restante del detector resulta de la diafonía en el chip, debido a la naturaleza compacta del dispositivo y podría usarse para la corrección de la diafonía. Una indicación de la operación adecuada del sensor en solución acuosa se puede ver en el ligero cambio de temperatura de ~0.09 ∘C en el transcurso de la inmersión de 1 min, y el pequeño aumento simultáneo de la señal del detector (~0.2 mV), luego de un proceso similar. comportamiento como en solución deuterada. Queremos enfatizar que este experimento se realizó entre dos mediciones de desnaturalización y no observamos ningún impacto o efecto negativo en el funcionamiento del sensor al comparar el rendimiento antes y después de la inmersión en el agua.

Señal del detector al operar el sensor QCLD en DI-H2O durante aproximadamente 1 min y aumentar la temperatura en aproximadamente 0,1 ∘C.

En el siguiente paso, la realización de un sensor QCLD en chip para experimentos de monitoreo de reacción similares, como los realizados anteriormente en D2O, pero que opera en una matriz altamente absorbente como el agua, requiere una geometría de dispositivo rediseñada. En tal caso, se necesitan longitudes de interacción plasmónica mucho más cortas, típicamente del orden de 10 a 15 μm, y son parte de nuestro trabajo futuro. La demostración fundamental presentada del funcionamiento del dispositivo monolítico en el agua abre la puerta para el uso de sensores QCLD similares, desbloqueando todo el campo de la monitorización de la reacción de IR medio en chip de muestras bioquímicas y farmacéuticas.

En conclusión, mostramos una próxima generación de laboratorio en un chip óptico de IR medio del tamaño de la punta de un dedo, adecuado para el análisis sensible y selectivo in situ en tiempo real de reacciones químicas en líquidos.

Analizamos el proceso de desnaturalización de la proteína BSA en una matriz de D2O con nuestro sensor, que opera en las longitudes de onda de 1597 cm−1 y 1620 cm−1. El QCLD se basa en la integración monolítica de un QCL, una guía de ondas DLSPP y un QCD en un solo chip miniaturizado. Permite mediciones in situ y en línea en tiempo real, sondeando en este último caso solo cantidades de microlitros de líquido. Su alto rendimiento se demuestra con un LOD muy bajo de 75 ppm en peso (=0,0075 % m v−1) y sigue la ley de Beer-Lambert hasta el 9,23 % m v−1 de concentración de BSA. Esto se confirma mediante una medición de la línea de calibración en todo el rango de concentración que abarca más de tres órdenes de magnitud. En una medición de desnaturalización de proteínas, revelamos el típico aumento de absorbancia en forma de s sigmoidal con el aumento de la temperatura de tratamiento de BSA, junto con una temperatura de transición dependiente de la concentración. Esto último podría demostrarse realizando mediciones de desnaturalización dinámica en concentraciones de 20, 40 y 60 mg ml−1.

Además, el comportamiento del sensor QCLD, cuando se sumerge en un líquido como BSA en D2O, se modeló mediante simulaciones basadas en FEM (COMSOL) de la sección de interacción plasmónica, incluido el analito. Muestran la excelente idoneidad de este tipo de sensor monolítico y materiales para detectar en una matriz de D2O y para observar procesos de desnaturalización térmica en una amplia gama de concentraciones de BSA. Esto presenta una demostración adecuada de un monitoreo de reacción dinámica en chip en tiempo real.

Después del análisis detallado de nuestro sensor en este trabajo utilizando una matriz de D2O, incluida una primera demostración del funcionamiento del dispositivo en condiciones reales de proteínas utilizando una matriz de agua, el siguiente paso será un estudio completo de los procesos dinámicos en condiciones biofísicas en H2O. Esto requerirá la geometría de guía de ondas plasmónica rediseñada y optimizada discutida, junto con una cuidadosa selección de longitudes de onda de medición para evitar los picos de absorción más altos en el agua. Con los resultados del trabajo actual, incluido el resultado de las simulaciones realizadas, ahora se puede implementar de forma sencilla un diseño tan optimizado.

Las mediciones de absorción FTIR de BSA se realizaron utilizando un espectrómetro FTIR Bruker Tensor 37 (Ettlingen, Alemania) equipado con un módulo Bruker Optics Platinum ATR (cristal de diamante, 1 mm2 con reflexión única) y un DLaTGS (sulfato de triglicina dopado con a-alanina de lantano deuterado) detector (D* = 6 × 108 cm \(\sqrt{{{{{{{{\rm{Hz}}}}}}}}}\) W−1 a 9,2 μm). Durante las mediciones, el espectrómetro se enjuagó constantemente con aire seco durante al menos 10 minutos antes de la adquisición de datos hasta que la absorción de vapor de agua fuera lo suficientemente constante. Los espectros se adquirieron con una resolución de 4 cm−1 en modo de adquisición de doble cara; la velocidad del espejo se fijó en 20 kHz. Se promedió un total de 26 escaneos (tiempo de medición: 60 s) por espectro, que se calculó utilizando una función de apodización de 3 términos de Blackman-Harris y un factor de llenado cero de 2. Todos los espectros se adquirieron a 25 ∘C. Los espectros ATR-FTIR registrados se trataron con corrección ATR avanzada y se analizaron con el paquete de software OPUS 8.1 (Bruker, Ettlingen, Alemania). Para las mediciones cuantitativas, se colocaron 30 μl de solución de BSA en D2O a concentraciones entre 1 y 50 mg ml−1 en el cristal ATR y se registraron los espectros FTIR. La sensibilidad, o pendiente m de regresión lineal, se utilizó para el cálculo del límite de detección (LOD), como sigue: LOD = 3 ⋅ RMS-ruido ⋅ m−1. El ruido de raíz cuadrática media (RMS) del instrumento se midió en la región espectral entre 1550 y 1650 cm-1 (con el número respectivo de escaneos) y la pendiente de la línea de calibración se determinó en 1597 cm-1.

Todas las mediciones (series de concentración y desnaturalización) con el sensor QCLD monolítico siguen la misma rutina: primero se realiza una medición de referencia en D2O puro (tiempo promedio por punto de datos: 2 s, tiempo típico de adquisición de datos: 30–60 s) como una línea de base, seguida directamente por la medición de BSA. Esto da como resultado una medición de referencia individual y precisa para cada medición que contiene BSA. En el caso de la medición de desnaturalización en la celda de microfluidos, lavamos la celda durante al menos 60 s con el analito a la concentración fija. Después de cada medición, purgamos, es decir, limpiamos, el sensor durante varios minutos con D2O para eliminar los residuos de la exposición previa a BSA de la superficie del chip.

Vale la pena señalar que el chip se sumergió y operó en una solución líquida durante más de 40 h en total. Esto incluye mediciones de calibración y purga con D2O puro, así como mediciones con BSA en D2O. El tiempo total de operación en un líquido se separa en tiempos con y sin polarización aplicada.

Las mediciones de absorción en chip de BSA se realizaron en base a la siguiente rutina de 3 pasos:

(i) Calentamiento: se prepara un vaso de precipitados que contiene 35 ml de BSA disueltos en D2O con tres concentraciones diferentes: 20, 40 y 60 mg ml−1. Luego, el analito se calienta constantemente (velocidad de calentamiento: ~0,1 ∘C) de ~20 ∘C a ~90 ∘C mientras se bombea continuamente mediante una bomba peristáltica (Ismatec Reglo ICC, 3 canales, 8 rollos) a una velocidad de 1 ml min-1 a la parte de enfriamiento de la configuración utilizando tubos de microfluidos adecuados.

(ii) Enfriamiento: para un enfriamiento rápido del analito líquido a la temperatura de medición de 21 ∘C, el tubo microfluídico se guía a través de un vaso de precipitados con H2O desionizada térmicamente estabilizada a ~ 20 ∘C. Debido al pequeño volumen de la solución de BSA en el tubo de microfluidos, unos pocos segundos en el líquido refrigerante son suficientes para enfriarlo de manera eficiente, incluso desde la temperatura máxima de calentamiento de 90 ∘C. Esto se confirma por un aumento de temperatura no observable dentro de la celda de medición a escala de microlitros para cualquiera de las temperaturas aplicadas del baño de calentamiento.

(iii) Conducción y medición: finalmente, el líquido se bombea a la celda de aluminio microfluídica hecha a medida (volumen: 60 μl) que se monta en la parte superior del chip sensor para demostrar sus capacidades de medición de microlitros. Mientras se estabiliza la temperatura de toda la celda a 21 ∘C, la medición se realiza polarizando el QCL correspondiente que opera a 1620 cm−1 (pulsos: 100 ns, frecuencia de repetición: 5 kHz, generador de pulsos Avtech AVL-2-B) y leyendo la señal QCD en el chip usando un osciloscopio de 350 MHz (Teledyne LeCroy HDO4034 2.5 GSPS). Luego, la muestra se bombea fuera de la celda de microlitros y se desecha.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos generados en este estudio se han depositado en la base de datos de Zenodo con el código de acceso https://doi.org/10.5281/zenodo.6930083.

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Se agradecen enormemente las conversaciones fructíferas con W. Schrenk y E. Gornik. Damos las gracias a A. Linzer y IC Doganlar de asistencia técnica de expertos. BH y MD recibieron financiación del Programa Marco Horizonte 2020 de la UE (proyecto cFlow, n.º 828893). Este trabajo fue financiado por el Centro COMET CHASE (proyecto No. 868615) dentro del programa COMET - Centros de Competencia para Tecnologías Excelentes por el BMK, el BMDW y las Provincias Federales de Alta Austria y Viena. El programa COMET está gestionado por la Agencia Austriaca de Promoción de la Investigación (FFG). BH reconoce la financiación del Austrian Science Fund FWF (M2485-N34) y AS a través de (proyecto no. P32644-N). PLS reconoce el apoyo recibido de CAPES-Brasil (88887.477460/2020-00). Se agradece el proyecto CzechNanoLab LM2018110 financiado por MEYS CR por el apoyo financiero de las mediciones en CEITEC Nano Research Infrastructure. AMA reconoce la financiación de EOARD/AFOSR (FA8655-22-1-7170) y de FFG bajo el número de acuerdo de subvención (883941, "Green Sensing MIR").

Instituto de Electrónica de Estado Sólido y Centro de Micro y Nanoestructuras, TU Wien, 1040, Viena, Austria

Borislav Hinkov, Florian Pilat, Patricia L. Souza, Mauro David, Daniela Ristanić, Benedikt Schwarz, Hermann Detz, Aaron M. Andrews & Gottfried Strasser

Instituto de Tecnologías Químicas y Analítica, TU Wien, 1060, Viena, Austria

Laurin Lux, Andreas Schwaighofer y Bernhard Lendl

LabSem-CETUC, Pontificia Universidad Católica de Río de Janeiro, Río de Janeiro, Brasil

Patricia L. Souza

CEITEC, Universidad Tecnológica de Brno, Brno, República Checa

herman detz

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BH, FP, LL, PLS y AS diseñaron los experimentos y realizaron las mediciones de líquidos; PLS caracterizó los dispositivos de cascada cuántica; HD y AMA hicieron crecer las estructuras de cascada cuántica; DR y BS fabricaron los dispositivos; MD realizó simulaciones numéricas; BH y AS analizaron los resultados; BH escribió el manuscrito con aportes editoriales de FP, AS, AMA, BL y GS; todos los autores leyeron el manuscrito y comentaron el artículo.

Correspondencia a Borislav Hinkov.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Chris Phillips y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

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Reimpresiones y permisos

Hinkov, B., Pilat, F., Lux, L. et al. Un laboratorio en un chip de infrarrojo medio para el monitoreo de reacciones dinámicas. Nat Comun 13, 4753 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32417-7

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Recibido: 14 febrero 2022

Aceptado: 29 de julio de 2022

Publicado: 13 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32417-7

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