Optimización de un alto

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 4588 (2023) Citar este artículo

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Se necesitan herramientas sensibles para detectar serotipos neumocócicos colonizadores concurrentes para una evaluación detallada del impacto directo e indirecto de la inmunización de rutina con la vacuna antineumocócica conjugada (PCV). Se desarrolló un conjunto de reacciones de PCR en tiempo real de nanofluidos cuantitativos de alto rendimiento (Standard BioTools 'Fluidigm') para detectar y cuantificar 92 serotipos neumocócicos en muestras clínicas archivadas. Para la comparación, se utilizaron hisopos nasofaríngeos recolectados entre 2009 y 2011 de niños sudafricanos ≤ 5 años, previamente serotipados con métodos estándar basados en cultivos. El conjunto de reacciones dentro de 'Fluidigm' amplificó efectivamente todos los objetivos con alta eficiencia (90-110 %), reproducibilidad (R2 ≥ 0,98) y bajo límite de detección (< 102 CFU/ml). Un análisis ciego de 1 973 muestras de hisopos nasofaríngeos mostró una sensibilidad diagnóstica > 80 % y una especificidad > 95 % en comparación con el método Quellung estándar de referencia basado en cultivo. El método qPCR fue capaz de serotipificar tipos neumocócicos con buena discriminación en comparación con Quellung (ROC-AUC: > 0,73). El método de PCR en tiempo real de nanofluidos de alto rendimiento detecta simultáneamente 57 serotipos individuales y 35 serotipos dentro de 16 serogrupos en 96 muestras (incluidos los controles), dentro de una sola ejecución de qPCR. Este método se puede utilizar para evaluar el impacto de las formulaciones actuales de PCV en la colonización de serotipos vacunales y no vacunales, incluida la detección de múltiples serotipos colonizadores concurrentes. Nuestro método de qPCR puede permitir el seguimiento de la carga bacteriana específica del serotipo, así como la aparición o transmisión en curso de serotipos menores o co-colonizadores que pueden tener potencial de enfermedad invasiva.

La cápsula de Streptococcus pneumoniae está compuesta por polisacáridos repetidos codificados genéticamente por el locus de Síntesis de polisacáridos capsulares (CPS) que confiere heterogeneidad de serotipo1,2. Hay 100 serotipos de S. pneumoniae bioquímica y serológicamente distintos3. La diversidad capsular es un factor de virulencia importante en S. pneumoniae4 y los serotipos tienen diferente potencial para causar enfermedades en humanos5. Las vacunas antineumocócicas conjugadas (PCV) previenen la adquisición del serotipo de la vacuna antineumocócica (VT), que es un precursor de la enfermedad6,7,8,9,10. La primera PCV con licencia (PCV7) estaba dirigida a siete serotipos, a saber: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F. Las PCV actualmente en uso en nuestro medio incluyen tres serotipos adicionales (PCV10: 1, 5 y 7F) y seis (PCV13: 1, 3, 5, 6A, 7F y 19A). Las PCV 15- y 20-valentes de próxima generación se encuentran en ensayos clínicos e incluyen dos (22F y 33F)11 y siete (8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F y 33F)12 serotipos adicionales, respectivamente, en comparación con PCV13.

La vigilancia de la colonización por neumococos de la vía aérea superior es útil para evaluar el impacto de la inmunización con PCV a nivel poblacional13. Las encuestas de colonización neumocócica se realizan mejor utilizando métodos de tipificación de serotipos completos, sensibles y precisos capaces de detectar múltiples serotipos coportadores, incluidos VT y serotipos no vacunales (NVT). Se necesita una vigilancia constante de los serotipos circulantes para informar las estrategias de vacunación y la utilización de PCV de valencia superior o alternativa, incluso adaptadas a diferentes regiones geográficas; y para la detección de serotipos emergentes o de reemplazo13.

Los métodos de Quellung basados en cultivos siguen siendo el estándar de oro para la serotipificación de S. pneumoniae; sin embargo, estos métodos requieren mucho tiempo, baja sensibilidad y son costosos14,15. En comparación con los métodos basados en cultivos, la detección y el serotipado basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) no dependen de la viabilidad del organismo que puede verse afectada negativamente por el uso de antibióticos, el transporte de muestras y las condiciones de almacenamiento, consumen menos tiempo, proporcionan un diagnóstico más rápido y una mayor sensibilidad15 . Se han utilizado PCR convencionales y en tiempo real, incluidas PCR anidadas y multiplex de un solo tubo con electroforesis en gel o capilar y combinadas con detección de transferencia puntual, enriquecimiento de cultivos y análisis basado en secuenciación16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28. Se han desarrollado métodos de PCR en tiempo real con un número cada vez mayor de serotipos detectados21,29,30,31, incluso en sistemas de alto rendimiento15,32,33. Además, los métodos de PCR cuantitativa (qPCR) que están validados para determinar la carga bacteriana29,31,32,34 son importantes para evaluar el impacto de las vacunas en los programas de salud pública. El aumento de la carga bacteriana en la nasofaringe puede predecir el potencial de enfermedad invasiva específica del serotipo31.

Anteriormente, desarrollamos un conjunto de reacciones de qPCR de nanofluidos que podía detectar y cuantificar simultáneamente 55 serotipos neumocócicos32, así como un método de detección y tipificación para distinguir los serogrupos 6A/B/C/D, 18A/B/C y 22A/F en serotipos individuales35 usando la misma plataforma. Aquí ampliamos nuestro método para detectar y cuantificar 38 serotipos adicionales, lo que permite una serotipificación neumocócica integral (92 serotipos) y la detección de otras 15 especies bacterianas para evaluar la colonización y la carga bacteriana en muestras respiratorias.

Para desarrollar un conjunto de reacciones completo para serotipificar S. pneumoniae y detectar otras especies que pueden estar presentes en la nasofaringe, dentro de una plataforma interna de PCR en tiempo real, nanofluídica, de alto rendimiento, una revisión del conjunto de ensayos publicado ( cebadores y sondas) secuencias. Las secuencias representativas de GenBank FASTA para los genes capsulares del serotipo 19B (CR931676) y 19F (CR931678), el gen de la proteína putativa Xisco neumocócica (NC_003028) y el gen de encapsulación Bex de Haemophilus influenzae (X54987) se alinearon en BioEdit usando la alineación ClustalW Multiple36,37. Los cebadores estándar y las sondas MGB marcadas con tinte se diseñaron manualmente para detectar el gen del polisacárido capsular 19F wzh para diferenciar 19F de 19B1,2, para detectar el gen Xisco neumocócico y para detectar el gen BexA de H. influenzae. Todas las secuencias de oligonucleótidos curadas para cada conjunto de ensayos enumerados en la Tabla complementaria S1 se analizaron para garantizar la especificidad in-silico utilizando la Herramienta de búsqueda de alineación local básica (NCBI BLAST; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) antes de su inclusión en el conjunto de reacción. La temperatura de fusión (Tm) de los oligonucleótidos individuales dentro de cada conjunto de ensayos se determinó utilizando las herramientas en línea Oligocalc38 y el OligoAnalyzer de Integrated DNA Technologies (IDT) (http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) para evaluar su idoneidad para su inclusión dentro de un perfil térmico uniforme y multiplexado. Se utilizó la herramienta IDT OligoAnalyzer para evaluar las estructuras secundarias y los sitios de autounión. La eficacia analítica (eficiencia, sensibilidad y especificidad) y el rendimiento diagnóstico (sensibilidad, especificidad y concordancia) del conjunto de reacciones concatenadas dentro de la qPCR en tiempo real de alto rendimiento de nanofluidos ('Fluidigm', Standard BioTools) se estableció a través de calibradores. y muestras clínicas respectivamente.

Las cepas de control se cultivaron de acuerdo con métodos de cultivo de microtitulación estándar para cuantificar su densidad relativa como unidades formadoras de colonias (CFU/ml) para su uso como calibradores de cuantificación y para evaluar la eficacia analítica. El ADN total se extrajo y almacenó a -30 °C hasta su análisis, como se describió anteriormente35. Se utilizó ADN de 89 aislados que eran representativos de los serotipos neumocócicos incluidos y otras 15 bacterias para optimizar los conjuntos de ensayos de PCR y evaluar la especificidad analítica de los conjuntos de ensayos para sus respectivos objetivos (serotipos neumocócicos: 1; 2; 3; 4 5; 6A; 6B; 6C; 6D; 7A; 7B; 7F; 7C; 8; 9A; 9L; 9N; 9V; 10A; 10B; 10C; 11A; 11B; 11C; 11D; 11F; 12B; 12F; 13 ; 14; 15A; 15B; 15C; 15F; 16A; 16F; 17A; 17F; 18A; 18B; 18C; 18F; 19A; 19B; 19C; 19F; 20; 21; 22A; 22F; 23A; 23B; 23F; 24 un ; 24B; 24F; 25A; 25F; 27; 28A; 28F; 29; 31; 32A; 32F; 33A; 33B; 33C; 33D; 33F; 34; 35A; 35C; 35F; 35B; 36; 37; 38; 39 , 40, 41A, 42, 43, 44, 45, 46, 47A, 47F, 48, Acinetobacter baumannii, Bordetella holmesii, B. parapertussis, B. pertussis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae-b, Haemophilus influenzae no tipificable, Klebsiella pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Neisseria lactamica, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus algalactiae y Streptococcus pyogenes). Los aislamientos de control se obtuvieron del Instituto Nacional de Enfermedades Transmisibles (NICD), Sudáfrica, el Instituto de Investigación Infantil Murdoch (MCRI), Australia y la Unidad de Investigación de Análisis de Vacunas y Enfermedades Infecciosas del Consejo de Investigación Médica de Sudáfrica (Wits-VIDA), Soweto , Sudáfrica.

Utilizamos fragmentos de genes de plantilla de ADN sintético de doble cadena (dsDNA) (gBlocks) como calibradores externos (Tablas complementarias S2 y S3) para la eficacia analítica y la variación intra e interensayo. Los gBlocks contenían secuencias para cada serotipo neumocócico u otro objetivo bacteriano según el grupo (Tabla complementaria S4) en el que se incluyeron los conjuntos de ensayos respectivos. Estos se aplicaron para evaluar la sensibilidad analítica (límite de detección) y la repetibilidad (variación intraensayo e interensayo y gráficos de Levy-Jennings) del conjunto de reacción. El diseño, propiedades y secuencias de cada gBlock se han detallado previamente35. Brevemente, para cada uno de los tres grupos (A, B y C, Tabla complementaria S4) se diseñaron tres gBlocks (nueve en total) que incluían cada uno de nueve a trece regiones objetivo. Las secuencias de destino dentro de gBlocks se cuantifican fácilmente ya que existe una proporción equimolar de todas las plantillas. La cantidad de ADN sintético gBlock se midió con el fluorómetro Qubit 2.0 Thermo Fisher Invitrogen Qubit 2.0 con el kit de ensayo Invitrogen Qubit dsDNA BR. El número de copias, o el número de genes equivalentes, se calculó mediante la fórmula:

La cantidad fue el promedio de las tres mediciones de Qubit que se multiplicó por el número de Avogadro (6.022 × 1023). La longitud en pares de bases se multiplicó por el peso promedio de un nucleótido de dsDNA (660 Daltons o g/mol) y se volvió a convertir a ng (1 × 109).

De mayo a octubre de 2009 y de mayo de 2010 a febrero de 2011, se realizaron dos encuestas de transporte en Agincourt, Mpumalanga y Soweto, Gauteng, respectivamente, para evaluar la colonización neumocócica específica de serotipo durante la fase inicial de introducción de PCV7 en Sudáfrica, que comenzó en mayo. 200939,40. Los aislamientos de carro de estas encuestas transversales se cultivaron previamente usando métodos microbiológicos estándar y serotiparon usando el método Quellung. Aquí, incluimos todos los hisopos nasofaríngeos (NPS) archivados disponibles de niños de 0 a 5 años de edad para evaluar nuestro método de serotipado neumocócico en los grupos de edad donde la colonización neumocócica fue más alta (Fig. 1). Retrospectivamente, todas las muestras archivadas, independientemente de los resultados del cultivo, se volvieron a analizar con 'Fluidigm', a menos que las muestras se agotaron o no hubo resultados de Quellung disponibles, para validar el conjunto de reacciones para la serotipificación precisa en muestras clínicas, como se describe en la Fig. 1. De las muestras clínicas archivadas de 1973 disponibles para el análisis actual, el 69,2% fueron positivas para neumococo por cultivo.

Diagrama de flujo de validación que describe las muestras clínicas archivadas incluidas que se serotipificaron previamente mediante el método Quellung basado en cultivo y que se compararon con la PCR cuantitativa y de serotipificación en tiempo real 'Fluidigm' de Standard BioTools. A09C indica muestras recolectadas de niños de Agincourt (2009)39. S10C indica muestras de niños de Soweto (2010/11)40. Las muestras fueron hisopos nasofaríngeos archivados en STGG como se describe en la sección "Muestras clínicas (hisopos nasofaríngeos) para validación", que se analizaron previamente con el método Quellung basado en cultivo39,40. Se utilizaron muestras clínicas archivadas para evaluar el rendimiento diagnóstico de la qPCR 'Fluidigm'. Cuando las muestras se indicaron como faltantes/agotadas, estas muestras no estaban disponibles para la extracción de ácido nucleico, ya que se agotaron a través de pruebas anteriores o no se localizó el vial de la muestra. Cuando las muestras se indican como fallidas/agotadas, la extracción de ácido nucleico falló y no quedó suficiente muestra para repetir esta extracción. Las muestras de control eran cepas de cultivo utilizadas para evaluar el rendimiento analítico de la qPCR 'Fluidigm' y se describen en la sección de métodos "Extracción total de ácidos nucleicos". Todas las muestras extraídas y los controles se analizaron en el 'Fluidigm'; sin embargo, solo las muestras con un resultado de Quellung (positivo o negativo) se incluyeron en las comparaciones del rendimiento del diagnóstico.

Las muestras (NPS en medios de transporte de leche descremada-triptona-glucosa-glicerina [STGG]) que se almacenaron a -80 °C se descongelaron y se agitaron a baja velocidad durante 30 s. Los ácidos nucleicos se extrajeron de 400 µl de STGG y se eluyeron en 100 µl de tampón de elución utilizando la plataforma automatizada de extracción de ácidos nucleicos BioMérieux NucliSens easyMAG (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia) de acuerdo con los protocolos estándar del fabricante. Se incluyó un control sin plantilla (NTC) que era STGG en blanco en cada lote de 23 muestras clínicas extraídas. Los ácidos nucleicos se almacenaron a -30 °C hasta su análisis.

La amplificación específica del objetivo (STA) se realizó según las recomendaciones del fabricante como paso inicial (preamplificación de ADN) para el sistema Biomark HD (Standard BioTools, anteriormente Fluidigm) como se discutió anteriormente35. En resumen, los conjuntos de ensayos (solo cebadores) se separaron en tres grupos multiplex de STA (Tabla complementaria S3) para evitar la reactividad cruzada de los cebadores. Después de la STA, la qPCR se llevó a cabo en el circuito de fluidos integrado (IFC) Dynamic Array de expresión génica (GE) Standard BioTools 96.96 (número de producto BMK-M-96.96) o en el Flex Six 12.12 GE IFC (número de producto 100-6308) contra un conjunto de reacciones que combina 96 muestras con 96 conjuntos de ensayos para 9 216 reacciones individuales de qPCR por matriz o 12 muestras con 12 conjuntos de ensayos para 144 reacciones por matriz, respectivamente. Un diagrama de flujo de la preparación y carga de Standard BioTools ("Fluidigm") 96.96 IFC se detalla en la figura complementaria S1 y se ha descrito en detalle anteriormente35. Brevemente, para cada muestra, se combinó el producto STA de cada uno de los tres grupos (5 µL) y 10 µL de H2O de grado molecular para diluir cualquier cebador restante. Posteriormente, la premezcla de ensayo para cada objetivo se aspiró en las entradas de ensayo IFC para obtener una concentración final de cebadores de 9 µM y sonda de 2,5 µM por reacción y muestras (2,25 µL de producto STA agrupado, 2,50 µL de Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Master Mix, número de catálogo 4370074 y 0,25 µl de reactivo de carga de muestra estándar de BioTools/Fluidigm) se aspiraron en las entradas de muestra. A continuación, se ejecutó el IFC en el termociclador BiomarkHD, utilizando las condiciones de ciclo térmico proporcionadas por el fabricante: 50 °C durante 2 min, 70 °C durante 30 min, 25 °C durante 10 min, 50 °C durante 2 min, 96,5 °C durante 10 min seguido de 40 ciclos de 96 °C por 15 s, 60 °C por 60 s. Los resultados se analizaron utilizando el software Fluidigm Real-time PCR Analysis. Aquí, los umbrales se definieron manualmente; la línea de base se asignó automáticamente y se aplicó un valor de corte de Ciclo de cuantificación (Cq) de 38.

Las curvas de calibración de regresión (curvas estándar) se prepararon para cada conjunto de ensayos utilizando diluciones en serie diez veces duplicadas de las cepas de control positivo objetivo o gBlocks. Las curvas estándar incluían cinco puntos de datos; los valores atípicos al final del rango que no contenían ciclos lineales de valores de cuantificación (Cq) se eliminaron para definir el rango dinámico lineal y el valor del coeficiente de determinación (r2). A una concentración de plantilla alta, los inhibidores de PCR tienen una concentración más alta, mientras que en muestras muy diluidas, la unión estocástica da como resultado una variabilidad en la amplificación. Por lo tanto, la plantilla concentrada o diluida o los errores de dilución afectarán la eficiencia de la amplificación, lo que dará como resultado valores de Cq impredecibles. Los valores que caen fuera del límite de linealidad ya no son predichos por la ecuación lineal. Por esta razón, se excluyen los valores atípicos. La eficiencia (%) de cada conjunto de ensayos incluido se derivó de la pendiente (m) de la ecuación lineal (y = mx + c) generada a partir de las curvas estándar utilizando la ecuación:

Se utilizó una serie de diluciones por triplicado de cepas de control bacteriano o gBlocks en el extremo inferior del rango dinámico lineal (103–100 copias por µL) para determinar la sensibilidad analítica o el límite de detección (LOD) definido como CFU/mL o copias más bajas detectado por triplicado de 'Fluidigm' qPCR. Se preparó una biblioteca de ADN de los serotipos neumocócicos específicos u otras especies bacterianas a un promedio de 103–104 CFU/mL. La especificidad analítica se evaluó analizando la biblioteca de ADN frente a cada conjunto de ensayos en la qPCR 'Fluidigm'.

Para los conjuntos de ensayos que se encontraban dentro de los rangos prescritos de eficiencia (90–110 %), se extrapoló la cuantificación relativa de la densidad bacteriana mediante la ecuación lineal generada a partir de las curvas estándar de los calibradores (cepas de control y gBlocks de densidad conocida) mediante la ecuación :

Cuando más de un conjunto de ensayos detectó o determinó un serotipo, se calculó la densidad promedio. Por ejemplo, para calcular la densidad del serotipo 6A:

La densidad relativa entre los serotipos se utilizó para asignar la jerarquía en el transporte de múltiples serotipos concurrentes, siendo los serotipos primarios los de mayor densidad y los serotipos subdominantes o co-colonizadores los de menor densidad relativa. Se construyeron gráficos de Bland-Altman (diferencia frente a medias) para comparar la densidad de LytA con PiaB y para comparar la densidad neumocócica promedio (LytA y PiaB) con la suma de la densidad de serotipos por muestra.

La sensibilidad diagnóstica se evaluó mediante un nuevo análisis ciego de las muestras clínicas almacenadas (n = 1973; fig. 1) que fueron previamente cultivadas y serotipadas mediante el método Quellung. Las muestras se volvieron a analizar con el conjunto de reacciones de qPCR dentro del IFC 96.96 que incluía el NTC extraído y los calibradores de cuantificación (gBlocks enumerados en las Tablas 2 y 3, o cepas de control a 104 y 103 CFU/mL). La prueba de McNemar se utilizó para comparar la detección de serotipos en el conjunto de reacciones de qPCR con la del método Quellung. Las muestras debían ser positivas para los genes de referencia neumocócicos LytA y PiaB para que se les asignara un serotipo positivo. Cuando no se detectaron estos genes neumocócicos, pero un conjunto de ensayos específicos de serotipo fue positivo, no se asignó ningún serotipo. La designación de serotipo por qPCR 'Fluidigm' y Quellung se consideró diferente cuando los valores de p fueron ≤ 0,05. Se utilizó el coeficiente kappa de Cohen para determinar la concordancia específica de serotipo de 'Fluidigm' qPCR y Quellung por muestra clínica. Los valores de kappa de < 0,20, 0,21–0,40, 0,41–0,60, 0,61–0,80 y 0,81–1,00 se consideraron concordancia deficiente, regular, moderada, buena y excelente, respectivamente. Los análisis se realizaron en Stata versión 13.0, incluida la aplicación de algoritmos relevantes para la asignación de serotipos.

La repetibilidad (varianza intraensayo) se determinó utilizando la desviación estándar (SD) para la variación en Cq de gBlocks ejecutados por triplicado dentro del mismo IFC en 103 equivalentes de genes. La reproducibilidad (varianza entre ensayos) se definió como la desviación estándar de la varianza de Cq para los gBlocks entre cuatro IFC diferentes.

Se obtuvo la aprobación ética del Comité de Ética de Investigación Médica Humana (HREC) de la Universidad de Witwatersrand para la recolección inicial de muestras (Soweto Cohort HREC: M090115; Agincourt Cohort HREC: M090114). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los tutores legales de los participantes como parte del estudio original en el que se obtuvieron muestras. Los métodos moleculares y el uso de muestras en este análisis fueron aprobados por el HREC de la Universidad de Witwatersrand (HREC: M170314). Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las guías y regulaciones locales e internacionales relevantes para las Buenas Prácticas Clínicas.

Se incluyeron un total de 96 conjuntos de ensayos en el conjunto de reacción final de qPCR 'Fluidigm'. La qPCR pudo detectar 92 serotipos neumocócicos y diferenciarlos en 35 serotipos en 16 grupos y 57 tipos individuales e identificar otras 15 especies bacterianas (Fig. 2, Tabla complementaria S4).

Resumen web de los 92 serotipos neumocócicos (57 serotipos individuales y 35 serotipos dentro de 16 serogrupos) detectados por el conjunto de reacciones 'Fluidigm'. Resaltados en gris están los serotipos de PCV7: 4, 6B, 9A/V, 14, 18C, 19F y 23F; Serotipos de PCV10: serotipos de PCV7 y 1, 5, 7A/F; Serotipos de PCV13: serotipos de PCV10 y 3,6A y 19A. NVT: serotipos no incluidos en PCV13.

La eficiencia de amplificación en todo el conjunto de reacciones fue excelente para 91 conjuntos de ensayos que se encontraban dentro del rango prescrito de 90 a 110 % (Tabla 1). Para estos conjuntos de ensayos, los puntos de datos se predijeron con precisión mediante la ecuación lineal de las curvas de regresión (r2 > 0,98, Tabla 1), lo que permitió la cuantificación relativa de la carga bacteriana utilizando la pendiente de la ecuación lineal. El rango dinámico lineal para estos conjuntos de ensayos fue al menos 5 veces logarítmica. Además, los gráficos de Levy-Jennings construidos utilizando calibradores de referencia específicos del conjunto de ensayos estaban dentro de ± 2,0 SD del valor medio de Cq en todas las placas. Esto validó el uso de los calibradores diseñados (gBlocks). Los conjuntos de ensayos para la detección de E. coli, Pneumocystis jiroveci, S. algalactiae, el gen Xisco de S. pneumoniae y el gen del ARN ribosómico 16S bacteriano (enumerados en la Tabla complementaria S1) no funcionaron bien dentro de este conjunto de reacciones. ya que la eficiencia fue < 90 % o > 110 % o r2 < 0,98 (Tabla complementaria S5).

La sensibilidad analítica fue alta para 91 conjuntos de ensayos incluidos (LOD: 10-100 equivalentes de genes, Tabla 1). Los conjuntos de ensayos se realizaron de forma consistente, con valores Cq de réplicas (n = 3) amplificados simultáneamente dentro de una placa de reacción (intraensayo) o en placas de reacción consecutivas (interensayo) dentro de ± 0,1 DE de la media. De los 96 conjuntos de ensayos dentro de la qPCR 'Fluidigm', 94 conjuntos de ensayos eran específicos para sus calibradores de control bacteriano específicos, y no se observó reactividad cruzada entre los conjuntos de ensayos. Dos conjuntos de reacciones, a saber, 10A y 33B, detectaron otros serotipos dentro del mismo grupo, es decir, 10B y 33C, respectivamente. Por lo tanto, estos conjuntos de ensayos se renombraron en consecuencia: 10A se renombró 10A/B y 33B se renombró 33B/C. Se aplicó un algoritmo de serotipado basado en el patrón de detección de todos los conjuntos de ensayos contra todas las cepas bacterianas objetivo para diseccionar algunos serotipos individuales, a saber: 6A, 6B, 6C, 6D, 10A, 11E, 12A/F/44, 18A, 18B, 18C, 18F, 19B, 22A, 23A, 38, 37, 33AF, 35F, 47A, 47F, S. pneumoniae no tipificable, H. influenzae no tipo b, H. influenzae no tipificable, B. pertussis, B .holmesii y B. parapertussis (Cuadro 2). Los conjuntos de ensayos para los serotipos 10B y 33C se incluyeron dentro del conjunto de reacción y, por lo tanto, la especificidad de la asignación de serotipos por parte del algoritmo no se vio afectada por los serotipos con reacción cruzada, ya que 10A y 33B no fueron detectados por estos respectivos conjuntos de ensayos. Por ejemplo, el serotipo 10A sería detectado por el conjunto de ensayo 10A y no por el conjunto de ensayo 10B y, por lo tanto, se le asignaría el serotipo 10A; mientras que el serotipo 10B sería detectado por el conjunto de ensayo 10A y el conjunto de ensayo 10B y, por lo tanto, se le asignaría el serotipo 10B.

Como el rendimiento diagnóstico se comparó con el método de Quellung, este solo se aplicó a los serotipos de neumococo. Además, el rendimiento diagnóstico de 'Fluidigm' no se pudo evaluar para conjuntos de ensayos dirigidos a especies bacterianas o serotipos neumocócicos que no se detectaron previamente en muestras clínicas archivadas utilizando métodos basados en cultivos (enumerados en la nota al pie de la Tabla 3). El método qPCR 'Fluidigm' fue capaz de clasificar correctamente los serotipos neumocócicos en comparación con el estándar de referencia (Quellung) y el área bajo la curva de la curva del operador del receptor (ROC-AUC) fue superior a 0,73 para todos los conjuntos de ensayos comparados (Tabla 3). La qPCR 'Fluidigm' distinguió dianas con > 80 % de sensibilidad (Tabla 3) en las 1 973 muestras clínicas archivadas para 36 conjuntos de ensayos. La sensibilidad diagnóstica para seis conjuntos de ensayos (1; 7B/C/40; 23A; 29; 33B y 35A/C/42) fue menor (50–74 %, Tabla 3) ya que la prevalencia de los serotipos objetivo detectados por Quellung fue ≤ 1 %, mientras que se detectaron serotipos objetivo adicionales mediante la qPCR 'Fluidigm' (Fig. 3). Los conjuntos de ensayos restantes no pudieron evaluarse como se explicó anteriormente. La especificidad diagnóstica fue alta (> 95 %) para todos los conjuntos de ensayos en los que Quellung detectó previamente serotipos objetivo (Tabla 3).

Prevalencia de serotipos individuales de Streptococcus pneumoniae detectados por el conjunto de reacciones de qPCR 'Fluidigm' en comparación con el método Quellung basado en cultivo. Los serotipos detectados en muestras tanto por 'Fluidigm' como por Quellung se clasifican como concordantes, mientras que las muestras detectadas por un solo método se clasifican como serotipos adicionales.

Hubo una buena concordancia entre el cultivo y la qPCR 'Fluidigm', y la mayoría de los conjuntos de ensayos detectaron el mismo serotipo con ambos métodos (kappa 0,61–0,8) con la excepción de los serotipos/grupos 1, 5 y 23A que tuvieron una concordancia regular (kappa 0,41-0,60) y los serotipos 7A/F, 11B/C, 12A/F/44, 33A/F, 35A/C/42, 35F y 38 que tuvieron una concordancia moderada (kappa 0,21-0,40). Cuando la concordancia se calificó como regular o moderada, esto se debió a la detección de estos serotipos en muestras adicionales mediante qPCR 'Fluidigm' en comparación con Quellung (serotipos 5; 23A; 12A/F/44; 35A/C/42 y 38), y además, donde hubo menos de cinco muestras totales detectadas por el método Quellung (serotipos 1; 7A/F; 11B/C; 33A/F y 35F) (Fig. 3). Para un conjunto de ensayos (serotipo 29), la concordancia se calificó como mala (κ < 0,20). Para este objetivo, la qPCR de 'Fluidigm' detectó una de cada dos muestras con el serotipo 29 utilizando el método Quellung basado en cultivos; sin embargo, otras ocho muestras que dieron negativo con Quellung se serotiparon como 29 con la qPCR de 'Fluidigm'. La qPCR de 'Fluidigm' fue más sensible para detectar todos los serotipos/grupos respectivos en comparación con el cultivo (prueba de McNemar: p < 0,05; Tabla 3), excepto para los serotipos 6C, 7A/F, 7B/C/40, 9L/N, 10A, 11B /C, 15B/C, 18C, 20, 21, 22F, 23B, 25A/F y 33B, donde no se detectó diferencia de clasificación entre los dos métodos (Test de McNemar: p > 0,05; Tabla 3). El conjunto de reacciones 'Fluidigm' pudo identificar un 39,1 % adicional (826/2113) de serotipos por encima de los detectados por cultivo para los conjuntos de ensayos comparados en la Tabla 3 y, por el contrario, el cultivo detectó 132 (9,3 % de 1419) serotipos no identificados por 'Fluidigm' qPCR (Tabla 3, Fig. 3).

La GMD (densidad media geométrica) para todos los serotipos y objetivos bacterianos se presenta en la tabla complementaria S6 y se resume en la figura complementaria S2, y la jerarquía de los serotipos neumocócicos co-colonizadores se presenta en la tabla complementaria S7. De los serotipos adicionales detectados por 'Fluidigm' qPCR, el 72,6% (831/1 144) eran serotipos co-colonizantes o de menor densidad en relación con el serotipo primario o de mayor densidad. La GMD de los serotipos adicionales detectados por la qPCR de 'Fluidigm' fue menor que cuando la designación del serotipo concordaba entre la qPCR de 'Fluidigm' y Quellung [2,3 (intervalo de confianza del 95 %/IC: 2,2–2,4) y 4,1 (IC del 95 %: 4,0 –4,2); Figura 4].

La densidad media geométrica (GMD) expresada como Log10 Gene Equivalents (GE)/mL determinada por 'Fluidigm' qPCR. Los serotipos concordantes (azul) se detectaron mediante el método Quellung basado en el cultivo estándar de referencia y 'Fluidigm'. Los serotipos adicionales son aquellos que fueron detectados solo por qPCR 'Fluidigm' (rojo).

Hubo una excelente concordancia entre la densidad neumocócica calculada a partir de los conjuntos de ensayos LytA y PiaB (línea de sesgo: − 0,2) en comparación con los gráficos de Bland-Altman (Fig. S3A complementaria). Además, solo el 6,9 % (58/836) de los puntos de datos estaban fuera del IC estrecho del 95 % (−1,7 a 1,3). La concordancia entre la densidad neumocócica promedio (LytA y PiaB) y la suma de la densidad de todos los serotipos (todos los conjuntos de ensayos específicos de serotipos) fue aceptable (línea de sesgo: − 1,2, figura complementaria S3B) con 5,8 % (45/776) de los datos fuera del IC del 95 % (−6,7 a 4,0). En el 7,8% (65/836) de las muestras positivas para neumococo no se detectaron serotipos y en otro 3,6% (30/836) la diferencia entre la densidad de neumococos y la densidad total de serotipos estuvo por encima del IC superior del Bland– trama de Altman.

Hemos desarrollado y validado un conjunto de reacción de qPCR de nanofluidos que es sensible, específico y reproducible para la detección y cuantificación precisas de 92 serotipos neumocócicos y otras bacterias colonizadoras dentro de 96 muestras (incluidos los calibradores) por placa de reacción. El rendimiento de los conjuntos de análisis descritos aquí es comparable con otros conjuntos de reacción-reacción de alto rendimiento para detectar el estado de portador neumocócico, incluso en la plataforma Standard BioTools 'Fluidigm'32,33 y en TaqMan Array Cards15 para LOD (< 103 CFU/ml) ; eficiencia (90-110%); rango dinámico lineal (quíntuplo) y linealidad (R2 > 0,98). En particular, la detección de serotipos adicionales (39,1 %) mediante el panel de qPCR 'Fluidigm' descrito aquí con 96 conjuntos de ensayos es comparable al panel 'Fluidigm' descrito anteriormente (también 39,1 %), que incluía 48 conjuntos de ensayos32. En comparación con el método de Quellung basado en cultivo estándar de oro, nuestro conjunto de reacciones tuvo una precisión del 98,8 % para la clasificación de los serotipos neumocócicos. Además, la sensibilidad promedio en el conjunto de reacciones de qPCR fue del 89,1 % en comparación con Quellung.

Las técnicas previas de serotipificación molecular han detectado serotipos comunes; sin embargo, no se detectaron otras TVN emergentes o poco comunes. La expansión de la variedad de serotipos detectables por métodos de mayor rendimiento se ha vuelto cada vez más importante a medida que la NVT reemplaza a la VT en el transporte41,42,43. También es importante detectar y asignar la carga o densidad bacteriana al transporte de múltiples serotipos (co-colonización) directamente a partir de muestras clínicas sin un paso de cultivo intermedio, lo cual es una ventaja de las técnicas moleculares sobre los métodos estándar basados en cultivos44. Previamente, la serotipificación incompleta se ha descrito como una desventaja de la serotipificación molecular en nuestro medio (Sudáfrica), donde la prevalencia de serotipos difiere de otras regiones geográficas45,46. Hasta donde sabemos, el método qPCR 'Fluidigm' descrito aquí es el conjunto de reacciones de serotipado molecular cuantitativo de alto rendimiento más completo desarrollado hasta la fecha.

En particular, Pai et al.25,26 desarrollaron un método de PCR multiplex convencional para determinar 29 serogrupos/tipos comunes, reducidos secuencialmente a 40 serotipos singulares. Azzari et al.21 utilizaron PCR en tiempo real para detectar 21 serotipos. Sakai et al.29 luego diseñaron 27 nuevos conjuntos de ensayos para detectar 72 serotipos/grupos. Pholwat et al.15 optimizaron una tarjeta de matriz Microfluidic TaqMan (TAC) basada en PCR que cubría 74 serotipos en hasta siete muestras clínicas por tarjeta. Sakai et al.30 desarrollaron además un conjunto de reacciones de qPCR para detectar 46 serotipos individuales y 33 serotipos dentro de 20 serogrupos. En el 'Fluidigm', Dhoubhadel et al.33 utilizaron la química SYBR Green para detectar 50 serotipos (16 serotipos individuales y 13 subgrupos). Messoudi et al.31 adaptaron los conjuntos de ensayos de Pai et al.26 en una PCR multiplex secuencial en tiempo real para detectar 40 serotipos o grupos utilizando sondas modificadas de ácido nucleico bloqueado (LNA). Juntos, estos estudios han fomentado el desarrollo de la serotipificación molecular y han proporcionado conjuntos de ensayos útiles para su uso en nuestra qPCR 'Fluidigm' que hemos optimizado aún más dentro de grupos multiplex de STA para detectar y cuantificar 92 serotipos neumocócicos, distinguiendo hasta 16 serogrupos y 57 serotipos individuales. Antes de nuestro estudio, las sondas modificadas no se habían utilizado en un sistema de alto rendimiento, como los sistemas de PCR de micro o nanofluidos, ni se habían recomendado en la plataforma "Fluidigm" de Standard BioTools. Nuestro estudio ha demostrado que estas estrategias de sonda modificadas funcionan bien en la qPCR nanofluídica 'Fluidigm' de alto rendimiento.

Debido al vínculo etiológico entre la alta carga bacteriana, el riesgo de transmisión y el potencial invasivo de los serotipos, la cuantificación de la carga bacteriana en los estudios de transporte es importante para evaluar el impacto de la vacuna. Aparte de los serotipos 12F, 8, 24F, 33F, 38 y 10A, se ha demostrado que la NVT involucrada en el reemplazo del serotipo de carro tiene un potencial invasivo bajo según los análisis de proporciones de casos a portadores47,48; sin embargo, los estudios moleculares han demostrado que una alta densidad bacteriana puede predecir el potencial invasivo de estos serotipos colonizadores. De los serotipos adicionales contenidos en PCV15 (22F, 33F) y PCV20 (8, 10A, 11A, 12F y 15BC), la qPCR 'Fluidigm' identificó un 0,3 % adicional del serotipo 8; 0,4% de 10A; 1,0% de 11A/D; 0,7% de 12A/F/44; 0,9% de 15B/C y 0,6% de 33A/F en comparación con cultivo. Un estudio molecular (multisitio: Sudáfrica, Brasil, Malí, Camboya y Francia) que comparó la carga bacteriana nasofaríngea de aislamientos invasivos con aislamientos portadores asintomáticos para serotipos sinónimos, encontró una carga bacteriana media cinco veces mayor en aislamientos invasivos (263,4 × 105 CFU /ml ± 57,07 × 105 frente a 49,9 × 105 UFC/ml ± 67,4 × 105)31.

La prevalencia bacteriana también puede estar intrínsecamente relacionada con la carga bacteriana que aumenta el riesgo de transmisión posterior. Por ejemplo, la prevalencia y la carga bacteriana específica del serotipo se compararon en un estudio vietnamita que incluyó a niños menores de 5 años ingresados en el hospital con infección respiratoria aguda (IRA) y niños sanos de la misma edad. Aquí, una alta carga bacteriana por serotipo se asoció con una mayor prevalencia tanto en casos de IRA (ρ de Spearman = 0,44, n = 186; p < 0,0001) como en niños sanos (ρ de Spearman = 0,41, n = 115; p < 0,0001).

Nuestro conjunto de reacciones no incluía los conjuntos de ensayos publicados anteriormente para 19F-Atípico, 19C y 23A; sin embargo, no encontramos ninguna indicación en el análisis in silico de que estos conjuntos de ensayos no detecten sus objetivos respectivos, y estos conjuntos de ensayos han funcionado bien en otros estudios15,29,30. Todavía se detectó el serotipo 23A en nuestro conjunto de reacciones utilizando un algoritmo que combina los resultados del conjunto de ensayos del serogrupo 23 (23A/B/F) y los conjuntos de ensayos dirigidos al serotipo 23B y 23F mediante el cual una muestra positiva para 23A/ B/F pero negativo para 23B y 23F se le asignaría 23A.

Si bien LytA y PiaB en combinación se describen como sensibles y específicos para la detección de neumococos, y la densidad calculada usando estos conjuntos de ensayos es concordante, Tavares et al.49 desde entonces recomiendan usar el gen regulador transcripcional putativo SP2020 combinado con LytA para una mayor especificidad. Estos cuatro conjuntos de ensayos (19F-Atípico, 19C, 23A y SP2020) deben validarse e incluirse en el conjunto de reacción para aumentar la detección a 94 serotipos, 16 serogrupos y 59 serotipos individuales. Los conjuntos de ensayos para la detección de E. coli, P. jiroveci, S. agalactiae, el gen Xisco de S. pneumoniae y el gen del ARN ribosómico 16S bacteriano no estaban bien optimizados dentro de este conjunto de reacción y, por lo tanto, solo pueden usarse para detección cualitativa de objetivos.

Existen desafíos para distinguir dentro de algunos serogrupos a serotipos singulares por nuestro conjunto de reacciones. Estos incluyen que un alto grado de reactividad cruzada entre serotipos genéticamente similares limita la discriminación a nivel de serotipo. Por ejemplo, los serotipos 7A/F y 9A/V difieren genéticamente en un solo nucleótido en una región difícil de identificar (contenido bajo de GC) con series de pares de bases homogéneos que darían como resultado un cebado erróneo para todas las estrategias de alto rendimiento descritas aquí2 . Estos requerirán estrategias más especializadas que no se ajustan a nuestro perfil térmico uniforme. Además, algunos serotipos se interconvierten in situ y pueden no caracterizarse clínicamente fácilmente en serotipos separados, como los serotipos 11A y 11E, 15B y 15C, o 35B y 35D, que existen en un "espectro" debido a la pérdida o ganancia incompleta de acetilación o transferasas50,51. Los dos últimos serogrupos, aunque contienen serotipos molecularmente distintos, tienen una distinción clínica problemática y, por lo tanto, deben interpretarse con precaución.

Otras limitaciones de este estudio incluyen que nuestro método requiere equipo especializado y personal experimentado (Standard BioTools, 'Fluidigm') que no es asequible en muchos entornos; sin embargo, este método se puede adaptar fácilmente a otras plataformas de qPCR en tiempo real. Cuando los serotipos no se distinguen de los serotipos individuales, la carga bacteriana para los serotipos detectados dentro de los grupos podría sobreestimarse si hay coportación de más de un serotipo dentro de un serogrupo, por ejemplo, el serogrupo 12A, 12F y el serotipo 44, o los serotipos 7B , 7C y serotipo 40. Dado que la colonización por la mayoría de estos serotipos no es alta en nuestro medio, no se espera que tenga un impacto muy relevante. La discriminación de estos serotipos individualmente será importante en entornos donde estos serotipos están en circulación o para evaluar la aparición de tipos no vacunales en la era posterior a la vacuna.

El método Quellung estándar de referencia se limita a la detección de colonizadores dominantes y de mayor densidad, mientras que nuestra qPCR 'Fluidigm' puede detectar múltiples colonizaciones concurrentes, incluso a menor densidad. Esto se debe a la inclusión de un método integral de serotipificación (conjuntos de ensayos que cubren la mayoría de los serotipos) y una alta sensibilidad analítica para detectar colonizadores de baja densidad. Estos beneficios de qPCR se traducen en comparaciones diagnósticas de estos métodos que subestiman la sensibilidad diagnóstica y la concordancia de 'Fluidigm' qPCR en comparación con los métodos Quellung basados en cultivo, especialmente donde la prevalencia de serotipos detectados por el estándar de referencia es baja. De hecho, este fue el caso de los serotipos 1; 7B/C/40; 23A; 29; 33B y 35A/C/42.

Otra limitación para la comparación de diagnósticos en nuestro estudio incluye el uso de muestras retrospectivas que se han sometido a múltiples ciclos de congelación y descongelación y se han almacenado durante alrededor de 10 años, lo que puede afectar la capacidad de cualquier método de diagnóstico para detectar patógenos con precisión. El método Quellung se llevó a cabo en 2010 (poco después de la recolección de la muestra) y detectó un 9,3 % adicional de serotipos que no fueron detectados por la qPCR 'Fluidigm'. Por el contrario, la sensibilidad analítica y la especificidad de la qPCR 'Fluidigm' se demostraron en todo el conjunto de reacciones cuando se usaron cultivos recién preparados o calibradores gBlock. Además, el conjunto de reacciones de qPCR 'Fluidigm' pudo detectar un 39,1 % más de serotipos que Quellung no detectó. Aquí, la densidad (GMD) de los serotipos adicionales detectados por la qPCR de 'Fluidigm' fue aproximadamente dos veces menor que la de los serotipos detectados de manera concordante por la qPCR de 'Fluidigm' y Quellung y la mayoría (72,6 %) eran serotipos subdominantes que serían menos probables para ser detectado por el método Quellung. No obstante, nuestro método fue capaz de serotipar las 1 973 muestras seleccionadas con buena concordancia y sensibilidad en comparación con Quellung.

El uso de la serotipificación basada en qPCR se basa en la detección de secuencias objetivo cortas dentro de un locus de síntesis de polisacáridos capsulares más grande, para asignar serotipos. La descripción reciente de los neumococos similares al serotipo 14 destaca una limitación de los identificadores genéticos cortos. En Papúa Nueva Guinea, a cuatro aislamientos de NPS de niños hospitalizados con infección aguda de las vías respiratorias inferiores se les asignó el serotipo 14 (una TV invasiva) mediante qPCR. Estos aislamientos fueron 'no tipificables' (no encapsulados) utilizando los métodos Quellung, aglutinación en látex y PneumoCaT. Los autores describen un perfil serológico divergente y la capacidad de escapar de la inmunidad provocada por la vacuna contra el serotipo capsular 14, a pesar de la similitud genética parcial. La secuenciación genómica de los aislados similares a 14 reveló mutaciones que interrumpen los loci biosintéticos capsulares, mientras que la secuencia corta del serotipo 14 dirigida por PCR estaba intacta52. Además, los pequeños cambios dentro de las secuencias objetivo, como los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), no se distinguen fácilmente con los métodos estándar de qPCR, mientras que estos cambios genéticos de un solo punto pueden alterar la estructura capsular, como lo ejemplifican los serotipos 6A y 6B53. La implicación de estos dos ejemplos es que, en algunos casos, la serotipificación molecular puede no identificar la diversidad antigénica o los nuevos serotipos, y se deben usar métodos alternativos de serotipificación para resolver las discrepancias.

En el 7,8 % de las muestras en las que se detectaron tanto LytA como PiaB, no se detectó ningún serotipo. Dentro del contexto de nuestro método, la detección diferencial de neumococo y serotipos puede indicar la presencia de neumococos no tipificables (NT) o, menos probablemente, serotipos no incluidos en nuestro conjunto de reacciones. En otro 3,8 % de las muestras positivas para neumococos, la diferencia en la densidad de neumococos y la densidad de serotipos totales estaba por encima del límite superior del intervalo de confianza del gráfico de Bland-Altman, lo que puede ser una estrategia útil para identificar los neumococos NT presentes en la co-colonización con otros serotipos. Sin embargo, este método de detección de neumococos NT en co-colonización utilizando los intervalos de confianza de las gráficas de Bland-Altman subestimaría la presencia de NT en densidades más bajas.

Una limitación de nuestro método implica la detección de regiones objetivo de serotipo capsular que han sido adquiridas por especies no neumocócicas presentes en la nasofaringe. Si bien incluimos que las muestras deben ser positivas tanto para LytA como para PiaB, donde los homólogos de serotipos no neumocócicos están presentes en la co-colonización con serotipos neumocócicos verdaderos, estos se asignarían como serotipos neumocócicos. Un ejemplo de este fenómeno es el Streptococcus mitis que expresa una cápsula del serotipo 154. En conjuntos de ensayos de destino donde la concordancia de qPCR con Quellung se calificó como pobre, regular o moderada utilizando kappa de Cohen (serotipos 1; 5; 7A/F; 11B/C; 12A/F/44; 23A; 11B/C; 29; 33A /F; 35A/C/42; 35F y 38), esto se debió a la detección de estos serotipos en muestras adicionales por qPCR. Cuando se detectan en la co-colonización, no podemos excluir que estos serotipos adicionales detectados sean siempre neumococos verdaderos. En el diagrama de Bland-Altman para la concordancia entre la densidad neumocócica promedio y la densidad de serotipos, donde la densidad total de múltiples serotipos colonizadores concurrentes fue mayor que la densidad neumocócica total y fuera del límite inferior IC del 95 %, esto puede indicar la presencia de no -Homólogos del serotipo neumocócico. Aquí proponemos que se lleve a cabo un análisis de secuenciación adicional cuando sea necesario para la confirmación de serotipos en la co-colonización, donde se detectan otros estreptococos no neumocócicos.

Uno de los grandes beneficios de nuestro estudio es la descripción del rendimiento por conjunto de ensayos de acuerdo con la información mínima para la publicación de las pautas de experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real (MIQE)55 y el gran tamaño de muestra de aislamientos con serotipos de Quellung disponibles para la validación de nuestro método.

Aunque configurar el conjunto de reacción dentro de la plataforma qPCR 'Fluidigm' de Standard BioTools es costoso inicialmente, las ventajas incluyen una gran reducción de los costos de mano de obra y el tiempo de espera debido a la gran cantidad de puntos de datos, ya que muchas muestras se prueban contra muchos diferentes los serotipos corren dentro de una placa. Nuestro método es relativamente rápido de realizar y puede generar resultados de 92 serotipos y 15 objetivos bacterianos para 180 muestras (dos análisis IFC) en un día. El costo por muestra nasofaríngea es de alrededor de USD $ 36, lo cual es muy favorable, considerando la serotipificación integral y la información cuantitativa generada por muestra. El conjunto de reacciones concatenadas dentro de la qPCR 'Fluidigm' de Standard BioTools será un beneficio en estudios de transporte grandes. El método debe validarse aún más para otras muestras clínicas, como sangre, esputo, líquido cefalorraquídeo y otros sitios donde se puede encontrar neumococo.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual y los códigos de Stata están disponibles de los autores correspondientes a pedido razonable.

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Nos gustaría agradecer al Consejo de Investigación Médica de Sudáfrica/Unidad de Investigación de Transiciones de Salud y Salud Pública Rural de Wits (Agincourt) que facilitó las colecciones de muestras originales en Agincourt. Del mismo modo, agradecemos al personal de las clínicas de VIH en el Hospital Académico Chris Hani Baragwanath y las clínicas de bienestar infantil en Soweto. Reconocemos al Instituto Nacional de Enfermedades Transmisibles de Sudáfrica, donde se llevó a cabo originalmente la serotipificación de Quellung basada en el cultivo. También agradecemos a todos los participantes de las inscripciones de Agincourt y Soweto que contribuyeron con muestras.

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Bill y Melinda Gates [Concesión No.: OPP1189378]. Hubo apoyo parcial del Departamento de Ciencia y Tecnología y la Fundación Nacional de Investigación: Iniciativa de la Cátedra de Investigación de Sudáfrica en Enfermedades Prevenibles por Vacunación; y el Consejo de Investigación Médica de Sudáfrica. Los patrocinadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Consejo de Investigación Médica de Sudáfrica, Unidad de Investigación de Análisis de Vacunas y Enfermedades Infecciosas, Escuela de Patología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Witwatersrand, Johannesburgo, Sudáfrica

Sarah L. Downs, Shabir. A. Madhi, Lara de los Merwe, Martha. C. Nunes y Courtney P. Olwagen

Departamento de Ciencia y Tecnología/Fundación Nacional de Investigación, Iniciativa de Cátedra de Investigación de Sudáfrica en Enfermedades Prevenibles por Vacunación, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Witwatersrand, Johannesburgo, Sudáfrica

Sarah L. Downs, Shabir. A. Madhi, Lara de los Merwe, Martha. C. Nunes y Courtney P. Olwagen

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SLD, SAM, MCN y CPO conceptualizaron y diseñaron el estudio y obtuvieron financiación. SLD fue responsable del diseño del conjunto de reacción, SLD y CPO fueron responsables del diseño de gBlock. SLD y LvdM realizaron los experimentos y el análisis qPCR. SLD realizó el análisis estadístico. SLD escribió el manuscrito inicial y todos los autores revisaron, contribuyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Sarah L. Downs o Courtney P. Olwagen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Downs, SL, Madhi, SA, van der Merwe, L. et al. Optimización de una PCR nanofluídica en tiempo real de alto rendimiento para detectar y cuantificar 15 especies bacterianas y 92 serotipos de Streptococcus pneumoniae. Informe científico 13, 4588 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31820-4

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Recibido: 02 Diciembre 2022

Aceptado: 17 de marzo de 2023

Publicado: 21 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31820-4

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